Závěrečná zpráva grantu 004/2002/C/1.LF

Název projektu:Studium změn v heteroplazmii mutace A3243G mtDNA v transmitochondriálních cybridech
Hlavní řešitel:Ing. Markéta Tesařová
Spoluřešitelé: Prof.MUDr. Jiří Zeman, DrSc.; Olga Brantová; Ing. Leona Černá, PhD
Období řešení:2002-2003
Celková dotace:474 tis. Kč

Souhrn výsledků

U řady pacientů s mitochondriálním onemocněním, kteří byli  diagnostikováni na enzymatické úrovni, není snadné rozlišit, zda se jedná o onemocnění, které je způsobeno mutacemi v mtDNA nebo v nDNA. Metodou pro identifikaci nukleárního nebo mitochondriálního původu poruchy funkce OXPHOS jsou komplementační studie pomocí transmitochondriálních cybridů, buňky vzniklé fúzí cytoplastů (enukleovaných buněk) a rho0 buněk (buňky zbavené vlastní mtDNA).  Cílem projektu bylo vytvořit rho0 buňky z imortalizovaných fibroblastů a ty následně použít pro tvorbu linií transmitochondriálních cybridů odvozených z cytoplastů nesoucích mtDNA mutaci A3243G.
Ve skupině 30 pacientů s mtDNA mutací A3243G byla studována tkáňová distribuce, mezigenerační segregace a funkční důsledky mtDNA mutace A3243G. U klinicky postižených pacientů byla zjištěna vyšší hladina heteroplazmie ve vlasových folikulech než u asymptomatických pacientů. Byl zjištěn náhodný přenos mutace mezi genracemi a nebyla nalezena korelace mezi hladinou heteroplazmie a změnami v aktivitách komplexů dýchacího řetězce.
Celkem 7 linií fibroblastů s mtDNA mutací A3243G bylo úspěšně imortalizováno pomocí transfekce plazmidem pRNS1. Po imortalizaci byly zjištěny výrazné změny v hladinách heteroplazmie, které mohou být důsledkem rozdílů v heteroplazmii mezi jednotlivými fibroblasty dané buněčné linie. V průběhu dlouhodobé kultivace fibroblastů a imortalizovaných fibroblastů nebyly zjištěny významné změny v hladinách heteroplazmie mtDNA mutace A3243G. Z imortalizovaných fibroblastů se nepodařilo připravit stabilní linie rho0  buněk, podobný neúspěch postihl i další zahraniční pracoviště. Proto jsme se vrátili k přípravě transmitochondriálních cybridů z rho0 buněk, odvozených z nádorových buněk 143B.TK-. Byly vytvořeny 2 linie transmitochondriálních cybridů, jedna vzniklá fúzi rho0 buněk a cytoplastů s mtDNA mutací A3460G, druhá vzniklá fúzí rho0 buněk a cytoplastů od pacienta s deficitem ATPsyntázy neznámé etiologie. V současné době se obě linie transmitochondriálních cybridů charakterizují.