Závěrečná zpráva grantu 005/2002/C/1.LF

Název projektu:	Úloha oxidu dusnatého v regulaci apoptózy a buněčného cyklu za různých patologických stavů
Hlavní řešitel:	MUDr. Tomáš Kučera
Spoluřešitelé:	Prof.MUDr. Jindřich Martínek, DrSc.; MUDr. Nikolina Kutinová-Canová; MUDr. David Veselý; MUDr. Hana Pácová
Období řešení:	2002-2003
Celková dotace:	345 tis. Kč

Souhrn výsledků

V rámci řešení našeho projektu jsme studovali několik aspektů role oxidu dusnatého (NO) v řízení apoptózy a buněčného cyklu. Vztah NO k apoptóze a buněčnému cyklu byl zkoumán jednak nepřímo na lidském materiálu a dále přímo v experimentech in vitro.
Přímý efekt NO na buněčnou smrt byl sledován u primárních potkaních hepatocytů, kde byl NO dodaný prostřednictvím donoru S-nitroso N-acetylpenicilaminu (SNAP). Při kvantitativním morfologickém hodnocení bylo zjištěno, že SNAP v koncentraci (200-800 µM) snížil spontánní pokles viability primárních potkaních hepatocytů. Při sledování účinku cyklosporinu A na primární potkaní hepatocyty byl zaznamenán jeho cytotoxický efekt, který se projevil poklesem viability buněk a rovněž inhibicí syntézy NO. Buněčná proliferace nebyla působením NO dodaného prostřednictvím SNAP, ani inhibicí syntézy NO cyklosporinem A ovlivněna. Při hodnocení nekrózy a apoptózy primárních potkaních hepatocytů bylo použito morfologických hledisek. Z palety testovaných imunocytochemických markerů apoptózy (Annexinu V, protilátky proti aktivované kaspáze –3, aktivované kaspáze –9 a štěpenému laminu A), považujeme použití průkazu obou aktivovaných kaspáz za nejvhodnější metodu detekce apoptózy s přihlédnutím k morfologii buněk.
Při práci s lidským materiálem jsme se zaměřili na patologické stavy postihující endokrinní orgány - štítnou žlázu a příštítná tělíska, o nichž je známo, že jsou spojeny s nadměrnou buněčnou proliferací, respektive akumulací buněk. Jednalo se o adenom příštítného tělíska, sekundární hyperplazii příštítného tělíska a nodosní strumu. U těchto patologií jsme zjišťovali, zda-li je při nich NO vytvářen. Byla provedena imunohistochemická detekce inducibilní izoformy syntázy oxidu dusnatého (iNOS) a endotelové izoformy (eNOS) na zmrazených řezech tkání, odebíraných při jejich chirurgickém odstranění. U nodosní strumy, sekundární hyperplasie příštítných tělísek a adenomu příštítného tělíska byla demonstrována přítomnost eNOS v bohatě vyvinutém cévním řečišti zásobujícím tyto tkáně. Exprese iNOS nebyla potvrzena v žádném z vyšetřovaných vzorků. Vliv oxidu dusnatého na buněčný cyklus epitelových buněk v těchto hypertrofických orgánech zřejmě spočívá v zajištění jejich cévního zásobení, které se zde vytváří v součinnosti s dalšími angiogenetickými faktory. Frekvence apoptózy je v těchto tkáních nízká, což ilustruje negativní průkaz aktivované kaspázy -3.
Na našem modelu in vitro - primárních potkaních hepatocytech - jsme prokázali cytoprotektivní působení NO. Role NO v patogenezi adenomu příštítného tělíska, sekundární hyperplasie příštítného tělíska a nodosní strumy souvisí nejspíše s jeho vaskulárními účinky.