Závěrečná zpráva grantu 005/2003/C/1.LF

Název projektu:Exprese a strukturální studie proteinu torsin A a jeho variant. Studium molekulární patologie dystonie, zapříčiněné mutaci v DYT1 genu
Hlavní řešitel:Mgr. Daniela Záhoráková
Spoluřešitelé: Prof.MUDr. Pavel Martásek, DrSc.; MUDr. Michaela Bodnárová; Ing. Ivan Mikula; Matouš Hrdinka
Období řešení:2003-2003
Celková dotace:299 tis. Kč

Souhrn výsledků

Cílem grantového projektu, plánovaného na 3 roky, bylo studium proteinu torsinA, který hraje klíčovou roli v patogeneze dystonie typu 1 a mutační analýza odpovědného DYT1 genu. Dystonie typu 1 je nejtěžší a nejčastější formou dystonií s nástupem symptomů v dětství. Projevuje se trvalými nebo opakovanými svalovými kontrakcemi, které vedou k abnormálním, často bolestivým pohybům nebo postojům. Onemocnění se dědí autozomálně dominantně s penetrancí 30-40%. Ve většině případů byl u pacientů popsán defekt v genu DYT1, který kóduje protein torsinA s dosud neznámou strukturou a funkcí. Projekt je zaměřen na expresi, purifikaci, biochemickou charakterizaci, krystalizaci a strukturální analýzu stabilní domény tohoto proteinu. Současně je prováděna mutační analýza DYT1 genu u nemocných s klinickými projevy dystonie typu 1.
Vycházeli jsme z cDNA pro kompletní lidský protein torsinA ve vektoru pOTB7 (American Tissue Culture Collection). Přítomnost cDNA pro torsinA byla ověřena sekvenováním 5´ a 3´ části vektoru s insertem. Metodou PCR jsme amplifikovali fragment, který na základě srovnávacích studií považujeme za stabilní doménu torsinu A. Tento úsek cDNA jsme klonovali do expresního vektoru pGEX-4T-1. S vektory řady pGEX jsou v laboratoři dlouholeté zkušenosti. Rekombinantní protein jsme exprimovali v transformovaných buňkách E. coli BL21 jako fúzovaný protein s glutathion-S-transferázou. Dosáhli jsme poměrně vysoké hladiny exprese a plánujeme purifikaci rekombinantního proteinu pomocí afinitní chromatografie s  následnou biochemickou a strukturální charakterizací proteinu jak uvedeno výše.
Souběžně jsme prováděli analýzu DYT1 genu u pacientů s klinickými příznaky dystonie, v prvním roce řešení jsme se zaměřili na nejčastější mutaci 946delGAG. Metodou PCR byla z gDNA pacientů amplifikována sekvence DYT1 genu obsahující místo mutace. Metodou RFLP s restrikční endonukleázou BseRI a sekvenací se nám přítomnost mutace 946delGAG zatím prokázat nepodařilo. V prvním roce řešení jsme položili základy pro úspěšné dokončení původního grantového záměru.