Závěrečná zpráva grantu 007/2002/C/1.LF

Název projektu:Dipeptidylpeptidase IV-podobné molekuly jako regulátory růstových vlastností gliomových buněk. Možný terapeutický cíl?
Hlavní řešitel:MUDr. Radek Malík
Spoluřešitelé: Prof.MUDr. Aleksi Šedo, DrSc.; MUDr. Zdeněk Kleibl, Ph.D.; Petr Bušek; Monika Majkovičová; Jan Bouček; Mgr. Petra Mokrá; Soňa Janáčková; Jan Ševčík
Období řešení:2002-2003
Celková dotace:533 tis. Kč

Souhrn výsledků

V souběhu s dalšími projekty laboratoře  byla nejprve provedena základní charakterizace buněčných linií z hlediska exprese molekul s DPP-IV enzymovou aktivitou (DASH molekuly). V buněčných liniích U87, U138 a Hs683 jsou přítomny 3 enzymově aktivní formy (označené č. 1-3). V ostatních buněčných liniích jsou přítomny pouze formy č. 2 a 3. Formy č. 2 a 3 jsou solubilní, forma č. 1 je převážně membránově vázaná. Formy č. 1 a 2 mají pH optima ve slabě alkalické oblasti (pH 7-8), forma č. 3 má slabě kyselé pH optimum (pH 5.5-6). Charakterizace pomocí nativní ELFO ukázala existenci celkem 7 bandů (Mm cca 70-500 kDa) s DPP-IV enzymovou aktivitou.
Dále byla určena exprese mRNA sledovaných DASH molekul v používaných buněčných  liniích a byly provedeny inhibiční studie s použitím inhibitorů „specifických pro DPP-IV“ a též dalších substancí. Výsledky neprokázaly specifitu žádné z testovaných látek pro některou z nalezených enzymových forem. Z kvantitativního hlediska bylo pro dosažení srovnatelné inhibice enzymové aktivity formy č. 3 za potřebí řádově vyšší koncentrace inhibitorů než u forem č. 1 a 2.
Dynamika expresního vzorce DASH molekul byla testována v podmínkách kultivace buněčných linií v médiu se sníženým obsahem séra. Enzymová aktivita  forem č. 1 a 3 se za těchto podmínek zvyšovala, nárůst byl časově závislý. Enzymová aktivita formy č. 2 se neměnila ani při úplné eliminaci séra s kultivačního média.
K funkčním studiím jednotlivých DASH molekul byly zavedeny metody RNA interference (RNAi) a metoda indukovatelné up-regulace pomocí  systému GeneSwitch.
Metoda RNAi byla testována na vyselektovaných buněčných klonech trvale exprimujících EGFP protein. Byly zkonstruovány vektory exprimující shRNA specifické proti EGFP a sledovaným DASH molekulám a byla zahájena transfekce těchto vektorů do používaných buněčných linií.
Pro up-regulační pokusy byly zkonstruovány expresní vektory pGene obsahující sekvence DPP-IV a atraktinu. Byla provedena transfekce buněčných linií regulačním vektorem pSwitch a příslušnými vektory pGene s následnou selekcí trvalých klonů.  Byly zkonstruovány vektory nutné k otestování funkčnosti obou metod. V rámci dalších projektů laboratoře probíhá konstrukce dalších vektorů a transfekce buněčných linií se selekcí trvalých klonů a jejich funkční analýzou.

Publikace, monografie, vyzvané přednášky a postery:
[1] Malík R., Bušek P., Mareš V., Ševčík J., Kleibl Z. & Šedo A.: Dipeptidyl peptidase-IV activity and/or structure homologues (DASH) in transformed neuroectodermal cells. Adv. Exp. Med. Biol. 524, 95-102.
[2] Malík R., Ševčík J., Kleibl Z. & Šedo A.: Dipeptidyl peptidase-IV activity and/or structure homologues (DASH) in glioma cell growth. 28th International Meeting of FEBS, Istanbul, Turkey, 2002. Eur. J. Biochem. 269, 47 (Abstract PS2-019).
[3] Malík R., Bušek P., Mareš V., Ševčík J., Kleibl Z. & Šedo A.: Dipeptidyl peptidase-IV activity and/or structure homologues (DASH) in transformed neuroectodermal cells. International Conference on Dipeptidyl Aminopeptidases, Berlin, Germany, 2002. Vyzvaná přednáška.
[4] Šedo A., Bušek P., Malík R., Vlašicová K. & Mareš V.: Impact of experimentally modified cell growth on the dipeptidyl peptidase-IV activity and/or structure homologues (DASH) in cultured glioma cell lines. 3rd General meeting of the International Proteolysis Society, Nagoya, Japan, 2003 (Abstract P2-6). Vyzvaná přednáška.