Závěrečná zpráva grantu 012/2001/C/1.LF

Název projektu:Vlastnosti normální a mutované CBS při sbalování a degradaci
Hlavní řešitel:Ing. Miroslav Janošík, Ph.D.
Spoluřešitelé: MUDr. Viktor Kožich, CSc.; MVDr. Zorka Novotná; Ing. Eva Starcová
Období řešení:2001-2003
Celková dotace:801 tis. Kč

Souhrn výsledků

Homocystinurie z deficitu cystathionin b-synthasy je relativně vzácné onemocnění s autosomálně recesivním způsobem přenosu. Postižení se klinicky projevuje již v dětském věku poruchami pojivové tkáně, cévního a centrálního nervového systému.
Naše skupina již delší dobu zabývá analýzou a molekulovými mechanismy mutací v genu pro CBS. Předběžné výsledky ukázaly, že některé mutace v CBS vedou k poruše sbalování a agregaci daného proteinu. Mutace zvyšují tendenci polypeptidu vytvářet nenativní (nefunkční) konformace, které jsou náchylnější k misfoldingu a agregaci. Chybně sbalené proteiny jsou kovalentně označeny ubiquitinem a směřovány do 26S proteasomu k degradaci. K zajištění správné struktury se podílejí další proteiny - chaperony. Chaperony jsou látky které se podílejí na správném sbalování proteinu uvnitř buňky. Chemickými chaperony pak nazýváme nízkomolekulární látky neproteinové povahy, které zabraňují chybné buněčné lokalizaci nebo špatnému sbalování mutantních proteinů.
Zkoumali jsme osud normální a mutované CBS exprimované v CHO buňkách. Nejprve jsme sledovali expresi GFP-CBS fúzního proteinu pomocí fluorescenční mikroskopie. Granulární signál mutantního GFP-CBS proteinu naznačuje vznik misfoldovaného a/nebo agregovaného proteinu. GFP signál jsme detekovali nejen v cytosolu, ale také v membránových strukturách, jako ER a Golgi. Pomocí elektronové mikroskopie a kolokalizace s protilátkami proti protein disulfid isomerase (PDI) jsme potvrdili přítomnost CBS v cytosolu a endoplasmatickém retikulu (ER). Pomocí elektronové mikroskopie jsme pak vyvrátili přítomnost agresomu v buňce .
Naše studie objasnila první informace o degradaci CBS v buňce. Zjistili jsme, že CBS není označena ubiquitinem pro degradaci v proteasomu. Navíc, jsme při inhibici proteasomu zaznamenali úbytek CBS ukazující na jinou degradační cestu mutantní CBS v buňce.
Abychom zjistili, zda lze misfolding farmakologicky ovlivnit, exprimovali jsme delEx12 a I278T mutanty v CHO buňkách v přítomnosti širokého rozmezí koncentrací chemických chaperonů (hemin, pyridoxal-5´-fosfát, betain, trimethylamin-N-oxid, glycerol, dimethylsulfoxid). Sledovali jsme mikroskopicky GFP fluorescenci, v buněčných extraktech pak CBS aktivitu a molekulový status pomocí nativního western blotu. Nejprve jsme zjistili efekt prekursorů kofaktorů CBS – hemu a PLP na aktivitu CBS. Inkubace s heminem zvyšuje CBS aktivitu del Ex12 a I278T mutantů. Přítomnost trimethylamin-N-oxidu zvyšuje aktivitu a množství normálně sbaleného tetrameru u mutanty delEx12.
Naše výsledky ukazují, že některé CBS mutanty můžou být částečně stabilizovány v aktivní konformaci zvýšenou koncentrací ligandů, případně chemickými chaperony. Chaperony by se mohly stát předmětem dalšího studia jako potencionální doplněk léčby homocystinurie.