Závěrečná zpráva grantu 013/2002/C/1.LF

Název projektu:Kyslíkové radikály v patogenezi mitopatií - úloha mitochondriální glycerol-3-fosfát dehydrogenázy
Hlavní řešitel:Mgr. Tomáš Mráček
Spoluřešitelé: MUDr. Josef Houštěk, CSc.; Ondřej Šebesta; MUDr. Pavel Ješina
Období řešení:2002-2003
Celková dotace:372 tis. Kč

Souhrn výsledků

Cílem grantového projektu „Kyslíkové radikály v patogenezi mitopatií – úloha mitochondriální glycerol-3-fosfát dehydrogenázy“ bylo studovat fyziologické konsekvence produkce kyslíkových radikálů na mitochondriální glycerol-3-fosfát dehydrogenáze (mGPDH) a pokusit se zodpovědět otázku, zda se tato produkce ROS může uplatnit jako patogenní mechanismus při vzniku mitochondriálních poruch.
 Při řešení jsme zavedli nové metody pro hodnocení oxidační aktivity u izolovaných mitochondrií i v intaktních buňkách pomocí fluoroforu H2DCFDA. Rovněž jsme zavedli metodiku pro měření obsahu redukovaného glutathionu v buňkách, který rovněž vypovídá o oxidační zátěži, kterou buňka prodělala.

Experimentálně jsme se zaměřili především na model indukce exprese mGPDH v játrech trijodtyroninem, který umožňuje dobré srovnání buněk kontrolních s buňkami se zvýšenou hladinou mGPDH. Prokázali jsme, že injekce trijodtyroninu indukuje expresi mRNA pro mGPDH následovanou vzestupem hladin proteinu a enzymové aktivity a detailně popsali časový průběh indukce.
Zvýšenou tvorbu peroxidu jsme detekovali polarograficky jako nárůst ferikyanidem indukované KCN insenzitivní respirace. Pro jednoznačný průkaz jsme poté využili fluorometrické stanovení produkce ROS s různými respiračními substráty. Glycerofosfát dependentní produkce ROS byla značně vyšší než produkce v přítomnosti sukcinátu. Intenzita produkce ROS velmi dobře korelovala a nárůstem aktivity a množství mGPDH proteinu.

Na modelu izolovaných hnědotukových adipocytů a placentálních mitochondrií jsme studovali další aspekty mGPDH dependentní tvorby peroxidu. Podařilo se nám prokázat, že exogenní koenzym Q a cytochrom c mají protektivní efekt na glycerofosfát dependentní produkci peroxidu.

Provedené studie přispěly k detailnější charakterizaci produkce ROS mitochondriální glycerol-3-fosfát dehydrogenázou která představuje nové místo tvorby ROS na respiračním řetězci. Experimenty umožnily zavedení nových vysoce citlivých metodik, které umožní další studium produkce ROS v intaktních buňkách pacientů s různými mitochondriálními chorobami.