Závěrečná zpráva grantu 024/2002/C/1.LF

Název projektu:Časový sled vývoje některých cytoskeletních proteinů spojený se změnami střevního epitelu
Hlavní řešitel:MUDr. Radomíra Vagnerová, CSc.
Spoluřešitelé: RNDr. Jiří Pácha, DrSc.; MUDr. Zdeňka Zemanová, CSc.; RNDr. Lucie Kubínová, CSc.; MUDr. Tomáš Kučera; Ivana Maršálková
Období řešení:2002-2003
Celková dotace:381 tis. Kč

Souhrn výsledků

Zabývali jsme se diferenciací střevních resorpčních buněk u člověka a laboratorního potkana od raných stádií prenatálního vývoje (lidská embrya od 16 mm t.k. délky a zárodky laboratorního potkana od 16. do 20. dne) a rozvojem některých strukturních proteinů cytoskeletu a transportních enzymů, alfa- a beta-podjednotek H,K-ATPázy. Pro porovnání byl sledován rozvoj bazolaterální alfa1-podjednotky Na,K-ATPázy. Proces vyzrávání střevních buněk byl sledován ve světelném a v elektronovém mikroskopu a posuzován podle exprese vybraných molekul ze skupiny aktin-vázajících mikrofilament apikálního cytoskeletu (villin), intermediárních filament (alfa-aktinin), molekul extracelulární matrix (vimentin) a funkčních molekul lamina basalis (laminin). V souvislosti s procesem proliferace a diferenciace střevního epitelu byla jako klíčový enzym exekuční fáze apoptózy prokazována aktivovaná kaspáza-3. Použili jsme standardní metodiku elektronové mikroskopie, polotenké řezy barvené toluidinovou modří a sériové parafinové řezy barvené hematoxylinem-eosinem. Imunohistochemické reakce byly provedeny na kryostatových a parafinových řezech. V časných stádiích je střevní sliznice kryta vysokým víceřadým epitelem a lumen je úzké, štěrbinovité, často zcela nezřetelné. Na polotenkých řezech pozorujeme intraepitelové vakuoly, odpovídající v submikroskopickém obraze sekundární luminizaci. V tenkém i v tlustém střevě jsou málo vyzrálé epitelové buňky s rovným povrchem bez mikroklků. V málo diferencovaných buňkách nejsou dosud patrná mikrofilamenta apikálního cytoskeletu, která pozorujeme až s rozvojem prvních mikroklků. S postupným dozráváním apikální membrány buněk od 17. dne pozorujeme v kolonocytech expresi villinu v typické lokalizaci s maximem v apikální membráně. Alfa-aktinin se v apikální membráně buněk objevuje již od 16. dne, i když jeho exprese je patrná i v mesenchymových a svalových buňkách. Také pozitivita alfa- a beta-podjednotky H,K-ATPázy se od 17. dne začala omezovat na luminální povrch kolonocytů. Pro porovnání: alfa1-podjednotka Na,K-ATPázy vykazuje již typickou bazolaterální lokalizaci. Na polotenkých řezech tenkého střeva nacházíme první slizniční řasy, které se postupně přestavují na primitivní střevní klky až do stádií kolem 50 mm t.k. délky u člověka a do 19. dne u zárodků laboratorního potkana. Epitel sliznice tlustého střeva prochází intenzivní přestavbou s tvorbou primitivních řas o něco později, mezi 18. a 20. dnem vývoje. V té době pozorujeme na vrcholech řas skupiny buněk, uvolňujících se z epitelu. V nediferencovaných kolonocytech u 18denních zárodků jsme zachytili při průkazu kaspázy-3 drobná pozitivní ložiska připomínající apoptotická tělíska. Řasy připomínají svým tvarem nevyzrálé střevní klky. Domníváme se, že nejde o přechodnou diferenciaci charakteristických klků, ale jen o slizniční řasy, mezi nimiž postupně vklesají a diferencují se krypty. Od 19. dne se také exprese lamininu omezuje na typickou lokalizaci při lamina basalis epitelu. Výsledky naší morfologické a imunohistochemické studie dokumentují proces strukturní a chemické diferenciace buněk střevního epitelu a postup vzniku typických složek cytoskeletu.