Závěrečná zpráva grantu 036/2001/C/1.LF

Název projektu:Funkční a morfologické aspekty poruch spermatogeneze u potkaní Hd mutace
Hlavní řešitel:Doc. MUDr. Zuzana Jirsová, CSc.
Spoluřešitelé: Doc.MUDr. Drahomíra Křenová, CSc.; MUDr. František Liška; MUDr. Tomáš Kučera
Období řešení:2001-2003
Celková dotace:413 tis. Kč

Souhrn výsledků

Potkaní hypodaktylie je autosomálně recesivní mutace provázená samčí sterilitou. Ve varlatech dospělých samců jsme prokázali poruchu spermatogenese, projevující se změnami prostorové organizace semenoplodného epitelu, která byla provázena redukcí počtu zárodečných buněk. Při řešení grantového projektu jsme se zaměřili na: a) postnatální cytodiferenciaci zárodečného epitelu varlat potkanů kmene Hd s cílem stanovit strukturní rozdíly u homozygotů a fertilních heterozygotů, b) detekci apoptózy buněk zárodečné linie s cílem zjistit mechanismus výrazné redukce počtu zárodečných buněk v semenoplodných kanálcích dospělých homozygotů, c) studium exprese proteinů účastnících se intercelulárních spojení v semenoplodném epitelu.
Varlata a nadvarlata infantilních, juvenilních, adolescentních a dospělých samečků byla zpracována standardní technikou pro vyšetření ve světelném a v elektronovém mikroskopu. U infantilních samečků nebyly zjištěny rozdíly ve stavbě. V semenoplodných kanálcích juvenilních heterozygotů byly pozorovány četnější mitózy spermatogonií. Nástup spermatogenese u obou typů byl provázen jednak degenerací zárodečných buněk, které byly uvolňovány do lumina tubulů, jednak strukturní maturací Sertoliho buněk, provázenou tvorbou jejich vzájemných těsných spojení. Rozdíly ve stavbě byly pozorovány ke konci 4. týdne postnatálního vývoje, semenoplodné kanálky homozygotů měly nižší a nepravidelnou distribuci zárodečných buněk. Varlata 52denních samců vykazovala značnou variabilitu ve stavbě semenoplodných tubulů - nálezy ložiskovité spermatogenese, nepravidelnou distribuci zárodečných buněk, ale i epitel s tak výrazným snížením počtu zárodečných buněk, že adluminální kompartment tubulu obsahoval pouze výběžky Sertoliho buněk. Porucha spermatogenese byla doložena i nálezy v epididymidis. Obsah ductus epididymidis u homozygotů tvořily pouze nezralé zárodečné buňky, degenerované elementy, reziduální tělíska a pouze ojedinělé spermie.
Ke sledování časných apoptotických procesů byla provedena imunocytochemická detekce M30 Cyto DEATH. Vyšetření neprokázalo zvýšenou expresi v semenoplodném epitelu v průběhu nástupu spermatogenese, ani významné rozdíly mezi homo- a heterozygotními samci. Podobné výsledky přinesla i detekce Annexin V Biotin. Při použití techniky TUNEL byly prokázány skupiny apoptotických spermatocytů, ale vyšetření neprokázalo významný rozdíl mezi Hd/Hd a +/Hd samečky. Exprese aktivované kaspázy-3 byla ve varlatech homozygotů nižší, pozitivní nálezy byly zjišťovány pouze lokálně a týkaly se spermatogonií, na rozdíl od heterozygotů, kde nástup spermatogeneze byl spojen s vyšší expresí kaspázy-3 v spermatocytech. Provedená vyšetření neprokázala zvýšený zánik zárodečných buněk v  semenoplodném epitelu homozygotů. Domníváme se, že primární příčina poruchy spermatogenese u Hd/Hd samců bude spíše na úrovni mechanismů regulace buněčného cyklu, což naznačuje i pokračující genetické a fyzické mapování oblasti nesoucí Hd gen na chromosomu 10.
Exprese Connexinu 43 (Cx 43), charakteristického gap junction proteinu semenoplodného epitelu hlodavců, byla sledována v průběhu postnatální diferenciace epitelu. První týden vývoje byla prokázána bodová exprese Cx 43 mezi podpůrnými buňkami. Nástup spermatogenese je obdobím ukončení proliferace Sertoliho buněk, zahájením tvorby jejich specializovaných intercelulárních spojení a zvýšenou expresí Cx 43. Semenoplodný epitel dospívajících homozygotů vykazoval nepravidelnosti v distribuci a počtu zárodečných buněk i v expresi Cx 43. V místech, kde Sertoliho buňky představují převažující buněčný typ tubulů, byla vedle horizontální exprese zjištěna i vertikální, což odpovídá submikroskopickým nálezům.