MUDr Gabriela Mahelková roz. Czakóová;
MUDr Marie Vaňková
Období řešení:
2001-2003
Celková dotace:
504 tis. Kč
Souhrn výsledků
V první fázi projektu byly isolovány prasečí alfa-, beta- a gama-krystaliny a po imunisaci myší připraveny proti nim monoklonální protilátky. Současně začala být vyvíjena in vitro systém kultivace prasečích epitheliálních buněk čočky (tj. systém jejich isolace z čočky a výběr vhodného kultivačního media). V druhé fázi nejprve byly otestovány připravené monoklonální protilátky, zavedena SDS gradientová polyakrylamidová elektroforesa pro separaci jednotlivých krystalinů a jejich detekce pomocí imunoblotování. Tímto systemem byly analysovány krystaliny jak zdravé lidské čočky, tak čoček s primární nebo sekundární kataraktou a byl nalezen diametrální rozdíl mezi populacemi krystalinů z primární a sekundární katarakty. přičemž krystaliny zdravé čočky vykazují charakteristiky smíšené. V další fázi pokusů bylo pracováno s větším souborem vzorků ze sekundárních katarakt extrahovaných sekvenčně PBS a poté močovinou a jako zdravé kontroly sloužily jednak celé čočky, jednak proliferující ekvatoriální část čočky. Bylo zjištěno, že gama-krystaliny se v materiálu ze sekundární katarakty nevyskytují (až na jednu vyjímku), zatímco proliferativní část zdravé čočky gama-krystaliny obsahuje, byť v nižším koncentraci než jiné části čočky. V populaci alfa-krystalinů ze sekundární katarakty byly nalezeny dva monomerní řetězce (19,0 a 21,4 kDa), které se ve zdravé oční čočce nenacházejí. Populace beta-krystalinů je z velké části kovalentně zpolymerovaná (až tetramery) dokonce i v poměrně mladé tkáni ze sekundární katarakty (byť v menším rozsahu) a tato polymerisace beta-krystalinů je vyšší v hůře rozpustném materiálu extrahovaném močovinou. Souběžně s touto biochemickou analysou sekundárních katarakt byl testován růst prasečích epitheliálních buněk in vitro na různých podkladech (sklo, polystyren, kolagen I a IV) a imunohistochemicky sledován jejich vliv na expresi krystalinů a alfa-aktinu (marker dediferenciace). Bylo zjištěno, že primokultury těchto buněk rostou hůře na skleněném podkladu. Buňky sekundární kultury se lépe přichytávají na kolagenu (I i IV), ale dále byl jejich růst už podobný na všech testovaných materiálech. Primokultury zachovávají diferencovaný stav (neexprimují alfa-aktin), ale sekundární kultury vykazují známky dediferenciace, méně, je-li jejich hustota vyšší a jsou-li kultivovány na kolagenu IV. Synthesu krystalinů se imunohistologicky prokázat nepodařilo (in vivo probíhá hlavně při diferenciaci epitheliálních buněk na fibrilární), ale pomocí imunoblotování se podařilo prokázat synthesu alfa- a beta-krystalinů v dlouhodobé primární kultuře, která morfologicky vykazovala podobnost s Elschigovými perlami (jeden typ sekundární katarakty). gama-Krystaliny v buňkách detekovány nebyly, což koreluje s našimi poznatky z analysy materiálu ze sekundárních katarakt. Zdá se, že primární kultura epitheliálních buněk čočky je poměrně dobrým in vitro modelem sekundární katarakty.