Závěrečná zpráva grantu 056/2003/C/3.LF

Název projektu:	Změny metabolismu železa u pozdní kožní porfyrie
Hlavní řešitel:	Prof.MUDr. Jiří Horák, CSc.
Spoluřešitelé:	Mgr. Andreas Nicodemou; RNDr. Ivana Půtova; MUDr. Markéta Čimburová; MUDr. Helena Michalíková; MUDr. Kateřina Červinková; Ivana Spoljarovičová
Období řešení:	2003-2003
Celková dotace:	296 tis. Kč

Souhrn výsledků

V rámci řešení grantového úkolu byl u skupiny 50 nemocných s pozdní kožní porfyrií vyšetřen metabolismus železa (siderémie, saturace transferrinu a koncentrace ferritinu). U 30 z nich byly vyšetřeny také dvě hlavní mutace HFE genu metodou PCR (H63D, C282Y), prokázáno bylo 8 heterozygotů pro mutaci H63D.
Nemocní se známkami akumulace železa měli být v dalším podrobně vyšetřeni včetně jaterní biopsie (po získání informovaného souhlasu) a měla u nich být rovněž provedena gastroduodenoskopie s odběrem biopsie duodenální sliznice ke stanovení exprese genů pro molekuly významné při transportu železa. Vzhledem k předčasnému ukončení grantu nebyla tato druhá fáze již realizována.
Paralelně probíhalo zavádění metodiky pro izolaci RNA příslušných transportních molekul z duodenální sliznice.
U 11 nemocných, u kterých prováděna gastroskopie z běžné diagnostické indikace (s normálními parametry metabolismu železa), byly odebrány vzorky duodenální sliznice pro stanovení RNA.
Izolace RNA probíhá následovně: bioptovaná sliznice (cca 30 mg) je uložena v mediu (RNA later –dodavatel Sigma, zabraňuje degradaci RNA).
Vlastní izolace probíhá na kolonkách pomocí Qiagen RNeasy Mini kitu od Qiagenu s použitím RNase-Free DNase setu rovněž od Qiagenu (pro štěpení DNA DNasou – zabránění kontaminace RNA).
Alternativní izolace RNA TriReagentem (dodavatel Sigma) s přidáním GenElute LPA Linear Polyacrylamid pro lepší izolaci i z malého množství tkáně. Následuje reverzní transkripce (RT) pomocí chemikálií (dodavatel Applera) a náhodných hexamerů (Random Hexamers dodavatel EastPort). Výsledkem je cDNA.
Kvantitativní PCR s cDNA po RT:
Sekvence primerů pro ferroportin (dodavatel Generi Biotech):
FP1 (forward primer) 5´- TgA CCA ggg Cgg gAg A
FP2 (reverse primer) 5´- gAg gTC Agg TAg TCg gCC AA
Kontrolní gen : GAPDH
Reakce probíhá za použití Sybr greenu PCR Master Mixu (dodavatel Applera).
Vlastní kvantitativní PCR reakce (Real Time PCR) probíhá na přístroji ABI PRISM 7000 Sequence Detection System (Applera).
Vzhledem k tomu, že byl přijat zákon č. 130/2002 Sb o podpoře výzkumu a vývoje z veřejných prostředků, bylo nutno grant ukončit po jednom roce řešení a tak nemohlo být dosaženo takových výsledků, aby je bylo možno
publikovat. Projekt byl ukončen v pokročilé fázi zavádění a ověřování výše popsané metodiky.

Přednášky v rámci grantového úkolu:
Horák, J.: Iron and liver. Prague Hepatology Meeting, Praha 5. – 7. 6. 2003
Horák, J.: Liver, alcohol and iron. 9th Congress of the European Society for Biomedical Research on Alcoholism. Praha, 11. – 14. 9. 2003

Publikace:
Horak, J.: Iron and liver. in: Lectures. Prague Hepatology Meeting 2003 (ed.: J. Horák), s. 187 – 190. ISBN 80-902883-8-3, 245 stran