Závěrečná zpráva grantu 111/2003/B-BIO/PřF

Název projektu:	Ekologická a genetická variabilita recentních a vymřelých populací perloočky Daphnia wierzejskii v alpinských jezerech Vysokých Tater.
Hlavní řešitel:	Mgr. Silvia Marková
Spoluřešitelé:	RNDr. Martin Černý, Ph.D.
Období řešení:	2003-2003
Celková dotace:	185 tis. Kč

Souhrn výsledků

Předkládaný projekt byl původně plánován na tři roky. V prvním roce jsme uskutečnili dva odběry ve Vysokých Tatrách (první- těsně po roztaní jezer (začátek července); druhý- na podzim (konec září) v období vrcholu reprodukce perloočky Daphnia pulicaria). V průběhu dvou vzorkování se odebral jak sediment s trvalýma vajíčky (pomocí odběrového zařízení- kóreru) ,tak živý vzorek planktonu (pomocí planktonní sítě a člunu, z nejhlubšího místa jezera, zpuštěním sítě na dno). Celkově jsme okorovali šest jezer a odebrali perloočky ze 14 jezer.
A) Z perlooček fixovaných v ethanole jsme extrahovali DNA , kterou jsme podrobili sekvenaci genu 16 S (část mitochondriálního genu malé podjednotky ribozomální RNA- 16S r DNA), čímž jsme získali 15 jedinečných sekvencí (12 sekvenci bylo získaných z populací ve Vysokých Tatrách, 3 sekvence z nížinných populaci, Hortobagy- Maďarsko, Nesyt, Bohdaneč- Čechy). Fylogenetický strom rozdělil pulicaria komplex do 2 hlavních skupin a to na vysokohorské a nížinné populace, vysokohorské populace byli dále rozdělené na 2 menší podskupiny. Do 1. podskupiny se vyčlenili tzv. oranžové klony a druhu podskupinu tvořili ostatní klony. Tatranské populace vykazují jistou variabilitu na géne 16S mezi sebou, největší je mezi oranžovými a bílými kloni ( Czarny Staw, Vyšné Temnosmrečianske pleso).
B) Z odebraných sedimentů jsme v laboratoři vybírali vajíčka v chitinózních obalech (efipia), která jsme otevírali pod stereoskopickou lupou a vajíčka označená jako vhodná použili na izolaci. Jak se ukázalo později, ani stav vajíček označených jako vhodná nebyl pro genetickou analýzu dostatečný (DNA byla rozštěpená, degradovaná). Na extrakci DNA z trvalých vajíček jsme použili několik isolačních technik (Proteinasa K, Chelax, CTAB, povaření ve vodě, v pufru, izolační kity Iso Quick, forenzní kit) avšak pokusy o amplifikaci mitochondriálních genů (16S, ND5) z trvalých vajíček byly neúspěšné. Proto jsme přešli na jinou genetickou metodu – mikrosatelity, která je citlivější, a proto používaná v populační genetice a hlavně amplyfikované úseky DNA u těchto markerů ne jsou delší něž 150 bp. Analýzu jsem provedla na pracovišti, kde je tato metoda rutinně používaná (laboratoř Dr. F. Dufresne, University of Quebec at Rimouski, Kanada). Na analýzu jsem použila osm různých markerů ( mikrosatelity Dpu 6, Dpu 7, Dpu 30, Dpu 40, Dpu 47.1, Dpu 45, Dpu 12.1, Dpu 122). Délka amplifikovaných úseků se pohybovala od 102 bp do 147 bp, proto jsme se domnívali, že tato metoda by měla být vhodná pro starobylou DNA z trvalých vajíček. Ani v jednom případě se nám nepodařilo starobylou DNA zamplifikovat, což svědčí o nevhodném stavu starobylé DNA v sedimentech námi odebraných šesti tatranských jezer. Pomocí této metody jsme zanalyzovali perloočky ze 14 tatranských jezer. Pro každý z osmi markerů byla zoptimalizovaná PCR reakce a na zviditelnění různých haplotypů následně použita analýza pomocí polyakryl-amidového gelu a fluorescenčního čítače FM BIO. Získali jsme několik různých elektromorf. Elektromorfy jsou identické v polohe (mají stejní délků- bp), ale nejsou nezbytně identické složením. Některé elektormorfy byli stejné pro vícero populaci a proto jsme v analýze pokračovali pomocí metody SSCP (single- strand conformation polymorphism), která umožňuje zviditelnění homoplazie. Homoplazia je definovaná jako maskovaní zjevně podobných evolučních rozdílů. Odhalení velkosti homoplazie může změnit fylogenetickou rekonstrukci populací. Výsledky SSCP jsou v současný době zpracovávaní. Rozdílné varianty elektomorf budou pro zviditelnění nukleotidových rozdílů osekvenované. Získané výsledky jsou připravovány ke společné publikaci řešitelů projektu s Dr. F.Dufresne. Obhajovaný projekt byl úspěšně rozběhnut. Na Jeho dokončení je nevyhnutný minimálne rok.