Závěrečná zpráva grantu 117/2003/B-BIO/PřF

Název projektu:Signalizační proteiny eukaryotického typu a jejich vztah ke kompetenci a virulenci u Streptococcus pneumoniae
Hlavní řešitel:Mgr. Lenka Přenosilová
Spoluřešitelé: Doc.RNDr. Jaroslava Svobodová, CSc.; RNDr. Pavel Branny, CSc.; Mgr. Linda Nováková; Petra Pallová
Období řešení:2003-2003
Celková dotace:285 tis. Kč

Souhrn výsledků

Dílčí výsledky získané během prvního roku trvání projektu zaměřeného na výzkum Ser/Thr proteinkinasy StkP a Ser/Thr proteinfosfatasy PhpP Streptococcus pneumoniae :
1. Připravili jsme deleční mutantu stkP-del a provedli analýzu změn fenotypu. Měřeno účinností transformace selekční značky (rezistence), mutanta stkP-del vykazuje až o dva řády nižší schopnost přirozené kompetence ve srovnání s divokým typem. Dále jsme zjistili, že během růstu v médiu s alkalickým pH (pH 8.0) mutanta stkP-del předčasně lyzuje, zatímco při pH 7.0 nikoli. Inaktivace hlavního autolyzinu LytA má za následek komplementaci lytického efektu mutace stkP-del. StkP tedy hraje roli v adaptivní odpovědi na alkalické prostředí inhibicí LytA-dependentní autolýzy.
2. Připravili jsme dvojitou deleční mutantu phpPstkP-del a provedli analýzu fenotypu s ohledem na ztrátu funkce proteinkinasy StkP. Na rozdíl od mutanta stkP-del, u kterého došlo ke ztrátě přirozené kompetence, byla kompetence dvojitého mutanta srovnatelná s kompetencí divokého typu (měřeno účinností transformace). To naznačuje, že oba procesy, tj. fosforylace a defosforylace zatím neznámého substrátu jsou funkčně spjaty s navozením stavu přirozené kompetence S. pneumoniae.
3. Delečního mutanta v phpP genu se nám opakovaně připravit nepodařilo. Pomocí série experimentů, kdy k homologní rekombinaci byly použity plasmidy obsahující buď interní část genu phpP nebo jeho 3'-oblast a celý gen stkP, jsme prokázali, že inzercí duplikací dochází vždy k obnovení funkce genu. To nasvědčuje tomu, že funkce PhpP je pro životaschopnost S. pneumoniae esenciální.
4. Připravili jsme mutantu S. pneumoniae, kde byla v genu stkP odstraněna jeho C-terminální část kódující transmembránovou oblast StkP a čtyři PASTA domény. Provedli jsme analýzu fenotypu a zjistili, že delece C-terminální části proteinu StkP vede ke snížení schopnosti navození stavu přirozené kompetence, a to až o dva řády ve srovnání s divokým typem S. pneumoniae.To poukazuje na možnou funkci C-terminální oblasti jako senzoru.
5. Provedli jsme první experimenty, jenž mají za cíl porovnání transkriptomů divokého kmene a mutanta stkP-del. Již první výsledky naznačují, že by tato globální analýza mohla umožnit alespoň částečnou rekonstrukci signální dráhy řízené Ser/Thr proteinkinasou StkP S. pneumoniae.
6. Abychom identifikovali substrát(y) proteinkinasy StkP, provedli jsme in vivo značení  32P-ortofosfátem kultur divokého kmene a mutanta stkP-del. Pomocí dvourozměrné vysokorozlišovací elektroforézy jsme analyzovali rozdíly v přítomnosti fosfoproteinů u obou kmenů. Porovnáním série dvourozměrných gelů jsme identifikovali 1-3 potenciální proteinové substráty StkP.

Část výsledků byla prezentována formou posteru na 1st FEMS Congress, Ljubljana, Slovinsko, 2003. Poster P9-27: L. Nováková, L. Přenosilová, P. Pallová, J. Echenique, M.-C. Trombe and P. Branny: Characterization of Streptococcus pneumoniae serine/threonine protein kinase StkP and protein phosphatase PhpP and their physiological function. Na PřF UK byla obhájena diplomová práce, ve které byla řešena problematika grantu - Petra  Pallová: Buněčná lokalizace Ser/Thr proteinkinasy Streptococcus pneumoniae a analýza funkce senzorové domény.