Závěrečná zpráva grantu 147/2002/B-BIO/PřF

Název projektu:Klíčové momenty životního cyklu parazitických prvoků ve hmyzích přenašečích
Hlavní řešitel:Mgr. Jan Votýpka
Spoluřešitelé: Mgr. Milena Svobodová, Dr.; RNDr. Petr Volf, CSc.; Mgr. Martina Hajmová
Období řešení:2002-2003
Celková dotace:231 tis. Kč

Souhrn výsledků

Na modelu Phlebotomus spp. – Leishmania major bylo vyzkoušeno několik způsobů zobrazení parazitů v trávicím traktu přenašečů a jejich přichycení k chitinózní výstelce (fluorescenční, konfokální, rastrovací a transmisní mikroskopie). Byly využity protilátky proti tubulinu a kutikulární výstelce, značené lektiny a kalkofluor. Leishmanie kolonizují celou oblast thorakálního střeva flebotomů, kde dochází k jejich přichycení pomocí bičíků nejen na výstelku stomodeální valvy (SV), ale též k mikrovilům střevního epitelu. Časté jsou též volně „plovoucí“ leishmanie. Nejlepší metoda pro studium změn SV při nákaze prvoky byla transmisní elektronová mikroskopie (TEM), pomocí které bylo jednoznačně prokázáno poškození SV infikovaných flebotomů v porovnání s valvami flebotomů nenakažených. Při nákaze dochází k odtržení chitinózní výstelky od epiteliálních buněk a k částečnému narušení její souvislé vrstvy. Dále se nám podařilo objevit doposud nepopsanou filamentózní strukturu na apikálním konci buněk stomodeální valvy, které je pravděpodobně spolu-zodpovědné za pohyblivost chlopní valvy. Také tyto filamentózní struktury jsou v důsledku nákazy leishmaniemi a trypanosomami výrazně poškozené. Takovéto poškození SV přispívá k přenosu parazitických prvoků do obratlovčích hostitelů.
Na modelu Culex pipiens quinquefasciatus – Trypanosoma sp. (CUL1) bylo zjištěno, že degenerativní změny na SV jsou obdobné jako u flebotomů nakažených leishmaniemi. Odlišností je způsob tvorby tzv. zátky v oblasti SV. Zátka z parazitů mechanicky ucpává oblast vstupu do prostoru kardie a omezuje tak sání krve. Na rozdíl od leishmania tvoří tuto zátku u komárů dvě odlišné formy buněk (malé a velké). Vazba na kutikulární výstelku SV komárů je u trypanosom vyšší než u leishmanií. Kontakt parazitů s mikrovilární vrstvou je pouze ojedinělý, zátka je mnohem kompaktnější a navíc se zde nevyskytují volně „plovoucí“ trypanosomy.
Na modelu Eusimulium latipes – Trypanosoma cf. avium (SIM3) bylo zjištěno, že u přirozeně nakažených ornitofilních muchniček se paraziti vyskytovaly v proktodeální části zažívací soustavy, především pak v rektální ampuli. Velké i malé formy, zastoupené v přibližně stejném poměru, se vyskytovaly jak ve volné formě, tak přisedlé ke kutikulární výstelce zadní části trávicí trubice. V místě nasednutí bičíku parazita na střevní stěnu muchničky byly patrné hemidesmozomální spoje, obdobné jaké se vytvářejí u trypanosom a leishmánií v místě přichycení na SV přenašečů. Pomocí molekulárně biologických metod (sekvenční analýza SSUa srovnání velikostí minikroužků kinetoplastové DNA) byla prokázána fylogenetická příbuznost trypanosom z muchničky s druhem T. avium. Přenos infekčních stádií parazita z muchniček na kanárky (perorálně i aplikací do spojivkového vaku) naznačil, že přirozenými hostiteli jsou patrně pěvci. Prokázaná odlišná infekčnost různých vývojových stádií trypanosom pro ptačí hostitele je důležitá zejména z metodického hlediska, protože pro experimentální infekce různých hostitelů jsou často využívána stádia parazitů z kultur (která byla v našem případě zcela neinfekční).
Herpetomonas ztiplika sp. n. V rámci studia trypanosomatidních parazitů krevsajících dvoukřídlích byl nalezen u tiplíka druhu C. kibunensis nový druh jednohostitelského kinetoplastida z rodu Herpetomonas. Na základě TEM a analýzy 18S rRNA je tato herpetomonáda součástí tzv. „bez-symbiontní“ větve herpetomonád. TEM dále prokázala existenci specifických cytoplazmatických výběžků na bázi bičíku, kterými jsou jednotlivé buňky vzájemně propojeny do rozet.