Závěrečná zpráva grantu 175/2002/B-FYZ/MFF

Název projektu:Monitorování intracelulárního pH kvasinek pomocí fluorescenčních sond
Hlavní řešitel:doc. RNDr. Jaroslav Večeř, CSc
Spoluřešitelé: doc. RNDr. Petr Heřman, CSc; RNDr. Aleš Holoubek; Mgr. Jan Maláč; doc. RNDr. Dana Gášková, CSc.; Ing. Kamila Chládková; Mgr. Hana Vaisocherová; RNDr. Roman Chaloupka, PhD
Období řešení:2002-2003
Celková dotace:174 tis. Kč

Souhrn výsledků

1. Byla vyvinuta modifikovaná metoda barvení buněk pomocí elektroporace, která je šetrná k živým buňkám. Místo jediného intenzivního vysokonapěťového pulzu jsme při barvení použily sledu krátkých VN pulsů. Aplikace této metody vedla k efektivnímu barvení buněk, přičemž nebyl pozorován nárust mrtvých buněk ve srovnání s neobarvenou suspenzí.

2. Odezva fluorescenční sondy pyraninu byla kalibrována novou metodou založenou na elektroporaci. Nastavení pH v buňkách bylo provedeno současně s jejich barvením elektroporací. Permeabilizace membrány způsobená aplikací HV pulsů vedla k okamžitému nastavení vnitrobuněčného pH na hodnotu pH použitého pufru.

3. Testovali jsme životaschopnost vyhladovělých pyraninem obarvených kvasinek při jejich skladování v citrát-fosfátovém pufru pH 6.0 při 4 C. v jednodenním itervalu jsme k suspenzi kvasinek přidávali glukózu a sledovali jejich odezvu: (a) bez zdroje energie nedochází k distribuci barviva, (b) rychlost odezvy buněk závisí na době skladování, (c) frakce mrtvých buněk začne narůstat čtvrtý den po obarvení, což koreluje s hodnotou maxima alkalinizace buněk dosaženého po přidání glukózy.

4. Při monitorování vnitrobuněčného pH jsme použilI poměrová fluorescenční měření, která jsou nezávislá na fluktuacích excitačního zdroje světla i stupně obarvení buněk. Intracelulární pH buněk bez zdroje energie se v pufrech s nastavenými hodnotami pH v rozmezí od 5.5 do 7.5 mění po několik hodin, aniž dosáhne rovnovážné hodnoty. Časový průběh pH přitom závisí na extracelulární koncentraci draslíku. Při jejím zvýšení dochází u buněk po časově omezenou dobu k vyšší alkalinizaci i proti protonovému gradientu nastavenému pufrem. Předpokládáme, že tento efekt je způsoben depolarizací buněk, neboť jeho časový průběh je podobný, jako průběh depolarizace, který jsme pozorovali po přidání draslíku potenciálově citlivými sondami.

5. Odezva pyraninu z cytosolu buněk byla porovnána s jeho chováním v pufrech obsahujících monovalentní ionty a albumín. Bylo zjištěno, že fluorescence pyraninu je citlivá na přítomnost obou komponent a podobá se emisi z buněk při jejich vysoké koncentraci.

6. U buněk obarvených pyraninem je možno sledovat změny propustnosti jejich cytoplazmatické membrány. Pozorovali jsme TYTO změny U buněk vystavených pH gradientům působením polyénového antibiotika nystatinu. Formování membránových pórů nystatinem vedlo ke změnám vnitrobuněčného pH detegovaným sondou.

7. Vyvinuli jsme unikátní fluorescenční metodu měření fluidity memrán v (pseudo)reálném čase. Tato metoda může být použita např. k detekci fázových přechodů v membránách v reálném čase.