Vliv fosforylace na strukturu a funkci 14-3-3 proteinů.
Hlavní řešitel:
RNDr. Tomáš Obšil, Ph.D.
Spoluřešitelé:
David Sojka;
Mgr. Kateřina Hofbauerová;
Mgr. Vladimír Kopecký
Období řešení:
2003-2003
Celková dotace:
160 tis. Kč
Souhrn výsledků
Hlavním cílem projektu bylo studium vlivu fosforylace na strukturu a funkci 14-3-3 proteinů. Sekvence 14-3-3 proteinů obsahují tři fosforylační místa: Ser-58, Ser-184 a Thr-232. V rámci řešení projektu jsme se zaměřili na studium vliv fosforylace Thr-232. Thr-232 je umístěn na C-konci molekuly 14-3-3 v těsné blízkosti vazebného místa pro fosfopeptidy. Protein 14-3-3zéta jsme připravili expresí v bakteriích E.coli a purifikovali standardními metodami. Purifikovaný protein byl fosforylován pomocí casein kinázy. Úroveň fosforylace byla ověřena pomocí hmotnostní spektrometrie. U takto připraveného proteinu jsme studovali změny jeho vazebných vlastností v důsledku fosforylace. Tato měření ukázala, že fosforylace Thr-232 signifikantně inhibuje schopnost 14-3-3 zéta vázat fosfopeptid. Dále jsme studovali vliv fosforylace Thr-232 na schopnost 14-3-3 aktivovat enzym serotonin N-acetyltransferázu (AANAT). 14-3-3 protein se váže na tento enzym a moduluje jeho strukturu a tím zvyšuje jeho enzymovou aktivitu. Zjistili jsme, že fosforylace 14-3-3 na Thr-232 téměř úplně inhibuje schopnost 14-3-3 aktivovat AANAT. Abychom objasnili molekulární mechanismus inhibice vazebných vlastností 14-3-3 zéta v důsledku fosforylace Thr-232, studovali jsme konformační změny molekuly 14-3-3 indukované fosforylací. Použili jsme metody dynamické fluorescence: časově-rozlišené dohasínání intenzity a anizotropie tryptofanové fluorescence. Pro studium konformačních změn 14-3-3 jsme pomocí cílené mutageneze připravili mutant, který obsahoval pouze jeden tryptofanový zbytek v poloze 242 na C-konci v blízkosti fosforylačního místa Thr-232. Dynamické fluorescenční studie Trp-242 ukázaly, že fosforylace indukuje konformační změnu C-koncového segmentu molekuly 14-3-3. Tato konformační změna je pravděpodobně zodpovědná za pozorované inhibiční efekty fosforylace na Thr-232. Studium strukturních změn 14-3-3 proteinu bylo doplněno molekulárně-dynamickými simulacemi možných konformací C-koncového segmentu. Tyto simulace potvrdily, že fosforylace Thr-232 výrazně ovlivňuje strukturu C-koncového segmentu.
Seznam publikovaných prací: Publikace v recenzovaných časopisech: Obšilová, V., Heřman, P., Večeř, J., Šulc, M., Teisinger, J., and Obšil, T.: 14-3-3zeta C-terminal stretch changes its conformation upon ligand binding and phosphorylation at Thr232. J. Biol. Chem.279, 4531-4540 (IF 6.7)
Přednášky na konferencích: Obšil, T. (2004) "Structural Biology of 14-3-3 proteins: Regulation of protein functions through protein-protein interaction". 1. Nové Hrady Winter Symposium on Structure nad Function of Proteins, Nové Hrady, January 22-24, 2004.
Postery: Obšilová, V., Heřman, P., Večeř, J., Šulc, M., Teinsinger, J., Obšil, T. "14-3-3 zeta C-terminal stretch changes its conformation upon ligand binding and phosphorylation at Thr232". 1. Nové Hrady Winter Symposium on Structure nad Function of Proteins, Nové Hrady, January 22-24, 2004.