Závěrečná zpráva grantu 008/1997/B-FYZ/MFF

Souhrn výsledků      

Jedním z hlavních cílů projektu bylo zformulovat soustavu rovnic obecného typu, z nichž by Goldmannova a Hodgkin-Horowitzova rovnice vyplývaly jako speciální případy. S tímto teoretickým cílem souvisel záměr provést sérii experimentů směřujících k precizování existujících metod měření membránového potenciálu v živých buňkách.
     V teoretické části projektu jsme ukázali, že Hodgkin-Horowitzovu rovnici, která se v literatuře uvádí jako alternativa ke Goldmannově rovnici, lze chápat jako důsledek lineární aproximace členu popisujícího drift nositelů náboje v transmembránovém elektrickém poli. Dále byl vytvořen teoretický model vlivu ionoforu valinomycinu na nastavení membránového potenciálu v buňkách, organelách a liposomech, jenž zahrnuje propojení efektu ionoforu valinomycinu s efektem jiných vodivostních mechanismů a umožňuje takto vysvětlit příčiny systematických chyb kalibrace membránového potenciálu buněk pomocí valinomycinu. Byly provedeny odhady Donnanových potenciálů v neuronech suprachiasmatického jádra u krys, s cílem odhadnout, jaké změny koncentrace vnitrobuněčných nedifuzibilních aniontů (pravděpodobně proteinů) jsou potřebné k vysvětlení změny charakteru neuropřenašeče GABA (kyselina g-aminomáselná ) z excitačního na inhibiční v průběhu vývoje. Byl teoreticky analyzován vliv změn koncentrace extracelulárního draslíku a regulace draselných kanálů na membránové proudy a potenciály Müllerových gliových buněk v sítnici.
       Experimentální část projektu byla úzce spojena s dlouholetým úsilím pracovníků biofyzikálního oddělení Fyzikálního ústavu UK dovést fluorescenční metody měření membránového potenciálu pomocí redistribučních sond do podoby zaručující lineární vztah mezi jejich odezvou a membránovým potenciálem. Pomocí metody popsané v práci Plášek et al., J. Fluores., 3 (1993) 157�159 byl analyzován vliv fotosensibilizátorů na membránový potenciál 3T3 buněk. Pomocí konfokálního mikrofluorimetru a sondy diO-C5(3) jsme zjistili, že fotosensibilizace vede k depolarizaci těchto buněk, jejíž příčinou je nejspíše snížení aktivity NA+,K+-ATPázy v jejich membránách. Podařilo se nám přispět k objasnění mechanismu změn emise, které provázejí akumulaci redistribuční sondy rhodaminu 123 v mitochondriích. Konkrétně jsme ukázali, že rozhodující roli hrají agregáty, které vznikají při sorpci molekul fluorochromu na proteiny a membrány.
     V posledním roce řešení projektu jsme se intensivně věnovali zdokonalování metody l-modulačního zobrazování, která s využitím rozmítaní vlnové délky budícího záření kolem excitačního maxima vybraného fluorochromu umožňuje eliminovat jeho příspěvek k pozorovanému fluorescenčnímu obrazu (idea metody je původní, vznikla na pracovišti řešitele). Tato metoda umožní eliminovat z fluorescenčních obrazů buněk studovaných pomocí redistribučních sond membránového potenciálu příspěvek frakce sondy vázané na intracelularní proteiny. Pomocí mikroskopie používající pouze optických filtrů tohoto nelze dosáhnout.