Závěrečná zpráva grantu 009/1997/B-BIO/MFF

Souhrn výsledků

Předmětem grantového projektu bylo studium krátkých sekvencí RNA, které vytvářejí vlásenky (hairpiny) umožňující ohyb RNA řetězce. Konkrétně byly pomocí metod optické spektroskopie (Ramanovy, FT-IR a UV absorpční) zkoumány strukturní rysy oktamerů typu 5´-r(GC-UNCG-GC)-3´a dekamerů 5´-r(CGC-GNRA-GCG)-3´ (kde N je libovolný nukleotid a R je purinový nukleotid). Tyto oligomery vytvářejí v roztoku za standardních podmínek hairpin se stonkem tvořeným dvěma respektive třemi G-C páry, který je uzavřen čtyřčlennou smyčkou typu UNCG respektive GNRA. Byl studován úplný soubor 4 různých sekvencí oktameru se smyčkou typu UNCG (kde N = A, G, U nebo C) a 8 různých sekvencí dekameru se smyčkou typu GNRA (kde N = A, G, U nebo C a R = A nebo G). Cílem projektu bylo ukázat, že metody vibrační spektroskopie lze aplikovat i na krátké oligomery se specifickými (a velmi lokálními) strukturními rysy. Rovněž byly zkoumány některé modelové polynukleotidy s cílem vybudovat spolehlivou „knihovnu“ referenčních spektrálních dat.
Z analýzy UV absorpčních křivek tání byly stanoveny základní termodynamické parametry všech studovaných oligomerů, které potvrzují vysokou stabilitu vlásenek se čtyřčlennou smyčkou. Křivky tání pro všechny vzorky odpovídají monofazickému a reverzibilnímu přechodu mezi uspořádanou a neuspořádanou strukturou. Pro oba typy smyček T_m závisí pouze slabě na typu druhého nekonzervativního zbytku (N). Pro smyčky typu UNCG se T_m nachází v intervalu 48,5-54,0°C a klesá s N v pořadí U>A>C>G. Pro smyčky typu GNAA T_m leží v intervalu 60,8-63,2°C zatímco pro GNGA leží v intervalu 55,7-58,7°C. Je ale zřejmé, že pro smyčky typu GNRA je T_m systematicky vyšší pro R = A ve srovnání s R = G.  Pozorovaný rozdíl v hodnotách Tm by mohl být vyvolán změnou polohy aminoskupiny při záměně A za G, což může způsobit přerušení některých vodíkových vazeb stabilizujících strukturu případně vést ke snížení stacking interakce s ostatními bázemi ve smyčce. Díky krátkému stonku ve studovaných vlásenkách lze ve vibračních spektrech pozorovat také konformační markery odpovídající jednotlivým nukleotidům čtyřčlenné smyčky. Tyto tzv. nukleotidové markery indikují, že u všech GNRA smyček je dominantním typem konformace 3´-endo/anti. V případě UNCG smyček byla jednoznačně potvrzena syn orientace terminálního guaninu a 2´-endo/anti konformace třetího rC zbytku. Díky silnému hypochromismu některých pásů v Ramanových spektrech lze získat i dosti ucelenou představu o stacking interakcích stabilizujících strukturu smyčky. Soubory teplotně závislých Ramanových spekter byly zpracovávány pomocí faktorové analýzy (algoritmus „singular value decomposition“), což mimo jiné umožňuje získat odhad hodnot T_m také z Ramanových spekter v dobré shodě s hodnotami získanými z UV křivek tání. Byly prováděny i molekulárně dynamické simulace struktury studovaných sekvenčních oligomerů.
Výsledky získané v rámci řešení tohoto projektu potvrzují, že metody vibrační spektroskopie mohou doplnit a rozšířit naše znalosti o struktuře krátkých sekvenčních oligomerů se specifickými strukturními rysy ve vodném roztoku. Vibrační spektroskopie tak představuje alternativní nástroj pro studium struktury krátkých oligonukleotidových sekvencí. Strukturním rozlišením nemůže nahradit ani konkurovat NMR, její potenciál však tkví právě v možnosti provádět srovnávací studie struktury souboru určitých blízkých sekvencí, jak jsme se pokusili demonstrovat na dvou typech čtyřčlenných smyček.