Souhrn výsledků
Projekt byl zaměřen na rozvoj metod,
které umožňují u nově syntetizovaných modifikací nukleových kyselin (NA)
vyhodnocovat na základě standardizovaných měření a počítačových simulací
fyzikálně-chemické vlastnosti, které mají význam pro jejich uplatnění v
chemoterapii. Při řešení projektu byly používány spektroskopické techniky
(Ramanův rozptyl, UV absorpce a NMR), kvantově-chemické výpočty a
molekulárně-dynamické simulace (MDS). Řešení projektu probíhalo v oblastech (i)
modelových systémů NA, (ii) analog mononukleotidů a (iii) modifikovaných
nukleotidů (potenciálních "antisense" léčiv). Syntetické látky byly
získány v Ústavu organické chemie a biochemie AV ČR, mikrospektroskopická
ramanovská měření prováděna v Laboratoři fyziky biomolekul a buněk (LPBC)
University Paříž VI. Konkrétně byly dosaženy následující výsledky:
Kvantově-chemickými metodami byla vyšetřena pseudorotační flexibilita pentozového
kruhu na molekulách tetrahydrofuranu, vypočítány vibrační frekvence a intenzity
Ramanova rozptylu a porovnáním s experimentálním spektrem získány podklady pro
interpretaci Ramanova spektra cukerné části nukleotidů.
Byla změřena a analyzována polarizovaná Ramanova spektra molekulárních krystalů
9-methyladeninu (mA) a 1-methylthyminu (mT) a porovnána se spektry směsného krystalu
9-mA:1-mT, kde jsou tyto báze spojeny Hoogsteenovými můstky. Bylo nalezeno několik
ramanovských markerů a zjištěno, že díky vodíkovým můstkům dochází ke
zpřahování vibračních módů 9-mA a 1-mT s blízkými frekvencemi.
Ze závislosti Ramanových spekter 9-[2-(phosphonomethoxy) ethyl] adeninu (PMEA) na pH
byly zjištěny rozdíly oproti přirozeným nukleotidům v oblasti nízkých hodnot pH,
kdy má molekula PMEA charakter obojetného iontu. Tato změna souvisí s působením
fosfonátové skupiny na adeninové residuum. Metodou ramanovské titrace a
měření paramagnetického zkrácení relaxačních dob NMR bylo zjištěno, že
(na rozdíl od dosud v literatuře prezentovaného názoru) při interakci PMEA s ionty
niklu je preferenčním místem interakce pozice N7 adeninu.
Byla vypracována metoda charakterizace vlivu modifikace internukleotidové spojky na
hybridizační vlastnosti nukleotidu, založená na spektroskopickém sledování
interakce mezi adeninovými dimery s modifikovanou spojkou (analogy diadenosin
monofosfátu) a polyuridylovou kyselinou (polyU). Při tvorbě komplexu dochází k
razantní změně řady pásů Ramanova spektra včetně snížení vibračních
frekvencí pásu uracilu 1625 cm-1 a pásu adeninu 1580 cm-1 v
důsledku vzniku interbázových vodíkových můstků. Metoda byla aplikována na
porovnání vlastností série modifikovaných izopolárních neizosterních
internukleotidových spojek, které jsou založené na vsunutí CH2 skupiny mezi fosfor a
esterový kyslík. Výsledky MDS potvrdily, že uvedená modifikace internukleotidové
spojky umožňuje modifikovaným ribonukleotidům vytvářet s komplementárním
řetězcem dvoušroubovicový komplex, která má strukturu a stabilitu srovnatelné s
komplexem přirozených partnerů.
Byla vyvinuta metodika, která umožňuje při dané teplotě určit konstanty stability
pro oba stechiometrické typy komplexů (duplex a triplex) ve směsných roztocích
adeninových a uracilových nukleotidů, a zároveň izolovat jejich spektrální
charakteristiky. Metoda spočívá ve spektroskopické titraci (UV absorpce a Ramanův
rozptyl), a fitu výsledků faktorové analýzy získané série spekter na rovnice
rovnováh pro komplexy 1:1 a 1:2. |