Závěrečná zpráva grantu 089/1999/C/1.LF

Název projektu:Studium deskvamace plicního vaskulárního endothelu na modelech akutního plicního poškození u potkana
Hlavní řešitel:Ing. Jan Šimák, Csc.
Spoluřešitelé: MUDr. Jan Janota; MUDr. Simona Bělohlávková
Období řešení:1999-1999
Celková dotace:170 tis. Kč

Souhrn výsledků

V prvni casti projektu jsme studovali akutni plicni vazokonstrikcni efekt fenfluraminu. Fenfluramin je anorektikum, ktere vyrazne zvysuje riziko primarni plicni hypertenze. Mechanismus tohoto efektu neni doposud znam. Anorekticky ucinek fenfluraminu je zprostredkovan jeho interakci v metabolismu serotoninu (5-hydroxytryptamin, 5-HT) v mozku. Snazili jsme se overit hypotezu, ze plicni vazokonstrikcni ucinek fenfluraminu je alespon z casti zprostredkovan aktivaci 5-HT receptoru. dale jsme se snazili zjistit, jestli farmakologicka inhibice aktivity napetove rizenych draslikovych kanalu (Kv) potencuje plicni vaskularni reaktivitu na fenfluramin. Na modelu isolovanych plic potkana perfundovanych  roztokem krebs-albumin jsme srovnavali inhibicni efekt ritanserinu,  antagonisty 5HT2 receptoru, na vazokonstrikci zpusobenou fenfluraminem a 5-HT. Oba agoniste 5-HT (10-5 mol/L) i fenfluramin (5x10-4 mol/L) zpusobovaly signifikantni zvyseni perfusniho tlaku. Ritanserin v davce (10-7 mol/L) dostatecne k inhibici > 80%  vazokonstrikcni odpovedi na 5-HT inhiboval pouze ~50% odpovedi na fenfluramin. Vyssi koncentrace ritanserinu (10-5 mol/L) kompletne inhibovala vazokonstrikcni odezvu na 5-HT avsak  inhibicni ucinek na fenfluramin se nezvysil.  Farmakologicka blokada Kv kanalu 4-aminopyridinem (3x10-3 mol/L) vyrazne zvysila vazokonstrikcni efekt fenfluraminu, avsak nemela zadny vliv na reaktivitu vuci 5-HT. Tyto vysledky naznacuji, ze plicni vazokonstrikcni ucinek fenfluraminu je castecne zprostredkovan 5-HT receptory. Navic, plicni vazokonstrikcni aktivita fenfluraminu je potencovana kdyz aktivita Kv kanalu je snizena. Tyto vysledky  podporuji hypotezu ze preexistujici nedostatecnost Kv kanalu muze byt predispozici nekterych pacientu k rozvoji plicni hypertenze pri  lecbe fenfluraminem. Rukopis teto studie byl zaslan do J of Pharmacology and Experimental Therapeutics (Encl.1).
V  dalsi casti projektu jsme studovali uvolnovani endothelovych mikropartikuli v plicni cirkulaci. Tvorba mikropartikuli vesikulaci plasmaticke membrany byla dokumentovana u stimulovanych desticek a take u ruznych typu bunek. O  endothelovych mikropartikulich je vsak znamo jen velmi malo. Na modelu isolovanych plic potkana, perfundovanych roztokem Krebs-albumin jsme studovali tvorbu mikropartikuli v plicnim racisti po stimulaci forbolmyristatacetatem (PMA). Aplikace 2ug PMA do plicni arterialni kanyly isolovanych plic potkana (250 - 300 g telesne hmotnosti) zpusobila po nejmene 5 min. lag fazy  zvyseni perfusniho tlaku . 15 min. po stimulaci  byl perfusni tlak vyrazne zvyseny az na 20 mmHg an byl pozorovan plicni edem.  30 min. po stimulaci PMA  byl pritomen tezky alveolarni edem a extreme vysoky perfusni tlak az 30 mmHg. ventilace plic byla nemozna a  byl pozorovan unik perfusatu. Hmotnostni pomer  vlhke/suche tkane prave plice byl > 8.0. S pouzitim prutokove cytometrie jsme analyzovali  v perfusatu plic mikropartikule vazajici annexin V a pokouseli jsme se o imunodetekci ruznych membranovych receptoru.  Po stimulaci PMA pocet mikropartikuli vazajicich annexin V v perfusatu  signifikantne vzrostl s maximem 2 min. po stimulaci. 5 min. po stimulaci se ponekud snizil a dalsi narust byl zaznamenan  15 - 30 min. po stimulaci s maximem ve 30. minute, kdy byl experiment ukoncen. Zaznamenali jsme vsak pokles poctu CD31+,CD34+,CD45+,CD54+ i  CD61+ mikropartikuli v perfusatu behem 30 min po stimulaci PMA. Jen pocet  CD45+ nebo CD54+  mikropartikuli mel tendenci se zvysovat v  pozdejsich fazich perfuse. Zaverem muzeme shrnout. Po stimulaci plicniho reciste potkana pomoci PMA jsme pozorovali  uvolneni mikropartikuli vazajicich annexin V. Casna faze uvolnovani mikropartikuli predchazela plicni vazokonstrikcni odpovedi a      edemu. Za nasich experimentalnich podminek pomoci dostupnych monoklonalnich protilatek se nam nepodarilo  mikropartikule charakterizovat. Velmi pravdepodobne,  pouziti FITC-konjugovanych Fab fragmentu protilatek a prutokoveho cytometru o vyssi rozlisovaci schopnosti by mohlo prinest reseni tohoto problemu. Vysledky teto studie jsou pripraveny pro posterovou presentaci (Enlosure 2) s doplnenim vysledku  soucasne probihajicich experimentu stanoveni endothelialnich antigenu v perfusatu pomoci  Western blottingu s odlisenim solubilni formy receptoru a receptoru vazanych na mikropartikule pomoci ultracentrifugace.  Tato cesta analyzy endothelovych antigenu se zda byt nadejnou.