Závěrečná zpráva grantu 112/1997/C/FaF

Název projektu:	Vliv glykace na aktivity a spektrální charakteristiky aminotransferas
Hlavní řešitel:	Prof.MUDr. Jaroslav Dršata, CSc.
Spoluřešitelé:	Eva Adámková; Božena Navrátilová; Mgr. Martin Beránek, PhD; Jana Crhová; Pavla Havlíková; Irena Žáková; Markéta Steidlová
Období řešení:	1997-1999
Celková dotace:	278 tis. Kč

Souhrn výsledků

Cílem projektu bylo sledovat glykaci aminotransferas (ALT, AST) vybranými monosacharidy in vitro. Práce navázala na předchozí spolupráci s ÚKBD Fakultní nemocnice v Hradci Králové, kdy byly aminotransferasy původně zvoleny jako významné enzymy, běžně stanovované v klinickobiochemických laboratořích. Výchozí výsledky ukázaly, že glykace těchto enzymů v plasmě není významná, pravděpodobně vzhledem k přítomnosti mnoha dalších bílkovin, reagujících s přítomnou glukosou. Tento projekt byl proto zaměřen na studium většího spektra monosacharidů: glukosu, fruktosu, galaktosu, D-glyceraldehyd a fosfáty některých těchto látek a jejich vlivu na čištěné enzymy v systému in vitro. Při řešení projektu bylo využito specifických vlastností obou enzymů, tj.
1) přítomnosti koenzymu pyridoxalfosfátu v aktivním centru, kde je vázán na lysin, tj. aminokyselinu obecně vystavenou glykační reakci, a současně
2) skutečnosti, že koenzym aminotransferas má charakteristické spektrální vlastnosti, poskytující možnost sledování absorpčního spektra a spektra cirkulárního dichroismu. Kromě toho, že tato CD spektra jsou oproštěna od všech opticky neaktivních složek absorpčního spektra, mohou ukázat i změny, jejichž základem je pouhá změna konformace nebo ionizace koenzymu v důsledku změny prostorového uspořádání aktivního místa enzymu nebo změny náboje v aktivním centru.
Základní mírou glykace byla aktivita enzymů, resp. vývoj inaktivace enzymů v čase v přítomnosti cukrů. Vedle toho byl u vybraných pokusů sledován podíl glykované a neglykované frakce, vazebnost 14C- značeného cukru (glukosa, fruktosa) a stanoveny AGE produkty.
Inaktivace enzymů závisela v souladu s očekáváním na reaktivitě monosacharidů v řadě glukosa, galaktosa, fruktosa, ribosa, glyceraldehyd. Inaktivace transaminas glukosou byla malá, pokusy se 14C- glukosou (inkubace, dialýza) přesto prokázaly nevratnou vazbu tohoto cukru na oba enzymy. Rychlost glykace obecně stoupala s teplotou (4°C, 25°C, 37°C), ačkoli některé výsledky naznačovaly paradoxně rychlejší inaktivaci glukosy při 4°C. Charakter interakcí cukrů s molekulou pyridoxalového enzymu pomohly vyřešit zejména spektrální studie. Výsledky řešení lze shrnout:
1) Relativně pevná vazby pyridoxal-5’-fosfátu v aktivním místě transaminas brání glykaci Lys v aktivním centru pyridoxalové (tj. výchozí) formy enzymu, takže přednostně jsou glykovány jiné lysinové zbytky v molekule. Při relativně nízkých koncentracích cukru se mění pouze ionizace koenzymu a tím dochází k přesunu od aktivní k neaktivní formě enzymu, což zřejmě přispívá i k snížené katalytické účinnosti glykovaného enzymu. Při vysokém poměru koncentrací cukr - enzym dochází ke glykaci lysinu i v aktivním místě. Pravděpodobnost glykace v aktivním místě stoupá též s reaktivitou cukru.
2) Při uvolnění lysinu v aktivním místě v první fázi katalyzované reakce (převedení pyridoxalové formy enzymu na pyridoxaminovou) dochází ke glykaci na tomto lysinu již při relativně nižší koncentraci cukru.
3) Změny signálu CD aromatických aminokyselin v molekule aminotransferas ukazují na konformační enzymové bílkoviny.
Vedle těchto poznatků lze konstatovat, že se aminotransferasy vzhledem ke svým vlastnostem (změny katalytické aktivity jako míra glykace, přítomnost koenzymu se specifickýni spektrálními charakteristikami podléhajícími změnám při ovlivnění aktivního centra) ukázaly jako vhodný model pro studie ovlivnění bílkovin glykacemi a testování látek ovlivňujících tyto děje.