Závěrečná zpráva grantu 113/1997/C/FaF

Název projektu:Studie vzájemných vztahů mikrosomálních monooxygenas a některých potenciálních cytostatik
Hlavní řešitel:Ing. Barbora Szotáková
Spoluřešitelé: Prof. RNDr. Eva Kvasničková, CSc.; Alena Pakostová; PharmDr. František Trejtnar, CSc.; RNDr. Lenka Skálová, Ph.D.; Doc. Ing. Vladimír Wsól, Ph.D.; Anna Šturmankinová; Andrea Navarová; Veronika Palicová; Alice Nosková; Drahoslava Šáfrová; PharmDr. Petr Jílek, CSc.; RNDr. Vladimír Buchta, CSc.; Petra Kopecká
Období řešení:1997-1999
Celková dotace:480 tis. Kč

Souhrn výsledků

Předmětem studia je potenciální cytostatikum oracin, 6-[2-(2-hydroxyethyl)aminoethyl]-5,11-dioxo-5,6-dihydro-11H-indeno[1,2-c]isochinolin, které inhibuje syntézu nukleových kyselin a bílkovin v kulturách nádorových buněk. Hlavními metabolity oracinu jsou 11-dihydrooracin (DHO) a 3-hydroxyoracin (3HO). Tyto metabolity byly u laboratorního potkana nalezeny na úrovni in vitro i in vivo.
Redukcí prochirální molekuly oracinu vznikají dva enantiomery (+)-DHO a (-)-DHO. Stereospecifita redukčních enzymů potkana byla sledována na různých úrovních. Experimentální studie byly prováděny na úrovni in vivo (moč, trus) a in vitro na úrovni orgánové (játra, ledviny), na úrovni celulární (izolované hepatocyty) a subcelulární (izolované mikrosomy a cytosol). U potkana je redukce stereospecifická ve prospěch (+)-DHO. Na mikrosomální úrovni je oracin redukován cytochromem P4501A a 11-b-hydroxysteroiddehydrogenasou (HSD). Podíl cytochromu P450 je mnohem menší než podíl HSD a jeho vliv se výrazněji projeví pouze po indukci podrodiny P4501A, kdy dochází k téměř trojnásobnému nárůstu vznikajícího DHO.  Současně byla věnována pozornost cytosolické redukci. Ze struktury oracinu je patrné, že redukci podléhá jeho ketonická skupina na uhlíku 11, a oracin by tak mohl být vhodným substrátem pro cytosolické ketonreduktasy. Tento předpoklad byl potvrzen, když aktivita ketonreduktas byla inhibována jejich specifickým inhibitorem quercitrinem. V jeho přítomnosti vzniklo při inkubaci s cytosolem nižší množství DHO proti neinhibované reakci.
Biotransformace oracinu na 3-hydroxyoracin je katalyzována mikrosomálními monooxygenasami cytochromového typu. Vznik tohoto metabolitu je vázán na aerobní podmínky a přítomnost koenzymu NADPH. Pomocí specifických induktorů, inhibitorů, substrátů a protilátek jsme určili rodinu i podrodinu cytochromu P450, který katalyzuje hydroxylaci oracinu na 3HO - cytochrom P4501A.
Oracin byl perorálně podán standardním laboratorním potkanům kmene Wistar a Fischer a bezmikrobním laboratorním potkanům kmene Fischer. Množství DHO získaného z moči i trusu bezmikrobních potkanů kmene Fischer bylo srovnatelné s výsledky nalezenými u standardních potkanů. Při anaerobní inkubaci kultury střevních bakterií potkana kmene Wistar a Fischer v médiu s přídavkem oracinu bylo určité množství vznikajícího DHO nalezeno.
Dále jsme sledovali aktivitu biotransformačních enzymů lokalizovaných na hladkém endoplazmatickém retikulu po jednorázovém a opakovaném podání oracinu potkanům, vůči substrátům, které jsou specifické pro jednotlivé isoenzymy cytochromu P450. Oracin byl potkanům podáván perorálně různě dlouhou dobu. V izolovaných mikrosomech byl stanoven obsah bílkovin, celkový obsah cytochromu P450, zastoupení některých isoenzymů cytochromu P450: 1A, 2B, 3A, 2E1. Nedošlo k signifikantnímu ovlivnění žádného ze sledovaných parametrů. Tento nález je z hlediska podávání oracinu pozitivní, protože změna aktivity biotransformačních enzymů může přímo ovlivnit délku nebo kvalitu farmakologického nebo toxikologického účinku oracinu nebo současně podaných jiných léčiv.