Závěrečná zpráva grantu 125/1997/C/1.LF

Název projektu:Identifikace inhibitoru hemopoetických progenitorových buněk v kostní dřeni po podání cyklofosfamidu
Hlavní řešitel:RNDr. Luděk Šefc, CSc.
Spoluřešitelé: MUDr. Karel Šulc, Doc. CSc.; MUDr. Emanuel Nečas, Prof. DrSc.; Dana Singerová; Dana Dyrová; Mgr. Viktor Sýkora; MUDr. Oskar Pšenák
Období řešení:1997-1999
Celková dotace:695 tis. Kč

Souhrn výsledků

Podání cyklofosfamidu  vede k poškození krvetvorných buněk i buněk hematopoetického induktivního mikroprostředí. Vzhledem k tomu, že mikroprostředí se skládá z více buněčných typů s odlišnou citlivostí k cyklofosfamidu, rozdílná míra poškození těchto buněk i jejich odlišná kinetika regenerace vede k dysregulaci podpůrné funkce mikroprostředí. V časné fázi po podání cyklofosfamidu (1-3 dny) je mikroprostředí kostní dřeně vysoce permisivní pro proliferaci progenitorů, které jsou prakticky všechny v aktivním buněčném cyklu. Od 5. do 7. dne po cyklofosfamidu je v kostní dřeni naopak proliferace progenitorů zcela potlačena. Cílem projektu bylo prozkoumat inhibiční aktivitu v kostní dřeni 5-7 dnů po podání cyklofosfamidu a přiřadit ji k některému známému inhibičnímu cytokinu, případně pokusit se izolovat a definovat neznámou aktivitu odpovědnou za inhibici proliferace. Na řešení projektu bylo poskytnuto cca 50% požadovaných prostředků. Bylo provedeno stanovení inhibiční aktivity v plazmě, sonikátech a primokulturách z kostní dřeně a sleziny po podání cyklofosfamidu. Uvedené vzorky získané z kostní dřeně 5-7 dnů po cyklofosfamidu nevykazovaly in vitro humorální inhibiční efekt na proliferaci progenitorů, na rozdíl  od pozorování in vivo. Byla zavedena metoda kvantitativní PCR využívající mutovaný kompetitor pro stanovení cDNA pro beta-aktin. Tato metoda byla použita ke srovnání nanášky cDNA při stanovování exprese jednotlivých cytokinů. Hladiny těchto cytokinů byly studovány metodou  semikvantitativní rtPCR.  V kostní dřeni 2 dny (stimulující mikroprostředí) a 5 dnů (inhibující mikroprostředí) po cyklofosfamidu byly testovány z hlediska inhibice následující cytokiny: MIP-1alfa, TGF-beta, IFN-gama, IL-10. Nebyl nalezen signifikantní rozdíl v expresi těchto cytokinů a a 5 dnů po cyklofosfamidu. Ze studovaných stimulačních cytokinů (CSF, TPO, flt3L) byla prokázána o dva řády vyšší exprese SCF v kostní dřeni 2 dny po CY ve srovnání s 5 dny po CY. Toto zjištění koresponduje s maximální stimulací proliferace kmenových buněk.
Dále jsme analyzovali složení kostní dřeně v průběhu regenerace po cyklofosfamidu jak mikroskopicky, tak průtokovou cytometrií. Po podání cyklofosfamidu prakticky vymizí z kostní dřeně CD4+ a CD8+ T-lymfocyty a graduálně dochází k úbytku B-lymfocytů. Mění sem optické vlastnosti buněk (FSC/SSC). Převažujícími populacemi v kostní dřeni se stávají granulocyty. Proliferační aktivita buněk kostní dřeně měřená inkorporací BrdU je na obr. 4. 7 dnů po cyklofosfamidu je již dřeň normocelulární, avšak její složení se stále výrazně liší od kontrolní dřeně. Krvetvorné progenitory byly magneticky izolovány na základě přítomnosti povrchového znaku Sca-1. Byla sledována jejich proliferační aktivita , procento podléhající apoptóze , a také přítomnost dalších povrchových znaků, jako jsou diferenciační markery (lin+), c-kit, flk2/flt3 a CD71. Progenitorové buňky vykazovaly vyšší apoptózu ve srovnání s ostatními krvetvornými buňkami. Po podání  cyklofosfamidu došlo k výraznému zvýšení počtu i procentuálního zastoupení Sca-1 progenitorů v kostní dřeni. Jejich proliferační byla vysoká, stejně jako podíl CD71+ buněk. Za 5-7 dnů po cyklofosfamidu počet a procento Sca-1 progenitorů v kostní dřeni výrazně poklesly. Tyto progenitory vykazovaly velmi nízkou proliferační aktivitu (Obr.5), CD71 a flt3 expresi a především došlo k významnému poklesu v zastoupení lin+ buněk ve Sca-1 populaci.
Závěr: Potvrdili jsme, že předpokládaná inhibiční aktivita, přítomná v kostní dřeni 5-7 dnů po podání cyklofosfamidu, není prokazatelná při in vitro kultivaci progenitorů s plazmou, s kondiciovaným mediem ani se sonikáty z kostní dřeně. V této době nedochází ke zvýšené expresi cytokinů  s popsanou inhibiční funkcí pro progenitory - MIP-1alfa, IL-10, TGF-beta a IFN–gama. Naopak dva dny po cyklofosfamidu jsme zjistili v kostní dřeni výraznou aktivaci exprese stimulačního cytokinu SCF. Dále jsme analyzovali složení kostní dřeně v průběhu regenerace po cyklofosfamidu a také změny v zastoupení, povrchových znacích, proliferační aktivitě a apoptotické frakci progenitorových buněk.  Dosažené výsledky byly prezentovány na 4 mezinárodních konferencích, byl publikován jeden článek, rukopis druhého připravený k publikaci přikládáme a další týkající se exprese cytokinů po cyklofosfamidu je ve stadiu přípravy.