Závěrečná zpráva grantu 131/1997/C/1.LF

Název projektu:Gaucherova nemoc exprese a charakteristika mutatní glukocerebrosidasy
Hlavní řešitel:MUDr Martin Hřebíček
Spoluřešitelé: doc.MUDr Milan Elleder, Doc; Eva Linxová; MUDr Zora Mělková, PhD; Ing Kateřina Hodaňová; Ing Markéta Červenková
Období řešení:1997-1999
Celková dotace:700 tis. Kč

Souhrn výsledků

Pacienti s Gaucherovou nemocí z deficitu glukocerebrosidasy (GCD) jsou ve většině dvojitými heterozygoty. U pacientů z nežidovských populací tvoří vzácné resp. privátní mutace 25-30% mutantních alel. Pro odlišení patogenních mutací od polymorfismů respektive neutrálních mutací je nutná funkční exprese mutantní GCD.
Zabývali jsme se expresí mutantních GCD v hybridním expresním systému vakcinie.  Exprimovali jsme zejména nové a vzácné mutace, které jsme nalezli v souboru českých pacientů s Gaucherovou chorobou. Cílenou mutagenesou jsme vnesli jednotlivé mutace do plasmidu pTM1-glu1, který obsahuje sekvenci cDNA lidské GCD pod kontrolou T7 promotoru. Správnost mutagenesy jsme ověřili sekvenováním.  Po transfekci plasmidu do buněčné linie BSC40 infikované WT virem vakcinie jsme v buněčné linii 143TK(-) za přítomnosti bromodeoxyuridinu selektovali rekombinantní viry.
Připravili jsme celkem pět rekombinantních  virů vakcinie, které nesly normální resp. mutantní sekvence cDNA pro lidskou GCD. Při koinfekci buněčné linie BSC40, respektive HeLa, virem VTF7-3, který exprimuje T7 RNA polymerasu  a  viry exprimujícími glukocerebrosidasu pod kontrolu T7 promotoru se podařilo dosáhnout vysokého stupně exprese - aktivita buněčné linie použité pro expresi normální GCD tvořila vždy méně než 4 % celkové b-glukosidasové aktivity. Mutantní GCD (mutace 1263del55, 1326insT, 72delC, S196P) měly výrazně sníženou b-glukosidasovou aktivitu - 5%  a méně aktivity normální GCD. Aktivita GCD nesoucí missense mutaci S196P  (průměrně 5% aktivity normální GCD) byla opakovaně vyšší než aktivity GCD nesoucí nulové mutací 1263del55,  1326insT, 72delC  (průměrně 1% aktivity normální GCD). U mutace S196P bylo na rozdíl od nonsense mutací rovnovážné množství proteinu zjištěné metodou Western blotting srovnatelné s normální GCD. U mutace 1326insT, která vede k předčasnému stop kodonu v 9. exonu  byla detekována GCD o snížené molekulové váze odpovídající předpokládané velikosti zkráceného proteinu.
Expresní plasmidy nesoucí mutace v cDNA pro GCD jsme využili také pro transientní expresi, která je laboratorně podstatně méně náročná. Celkem jsme exprimovali čtrnáct různých GCD (WT-glu1, 72delC, 1326insT, 1263del55, S196P, N370S, L444P, V460V, G202E, D409H, T369M, V294V, L444P+V460V, D409H+T369M, 1263del60).  Buněčná linie BSC40 nebo HeLa byla infikována virem VTF7-3. Expresní plasmidy jsme vnesli do buněk pomocí lipofekce  a po 24 hodinách jsme v buněčných lysátech měřili b-glukosidasou aktivitu a množství imunoreaktivního proteinu. Při expresi normální GCD tvořila vlastní b-glukosidasová aktivita buněčné linie 25% (u buněčné linie BSC)  resp. až 70 % (u buněčné linie HeLa) celkové  b-glukosidasové aktivity. Vzhledem ke své relativně vysoké b-glukosidsové aktivitě je buněčná linie Hela nevhodná pro transientní expresi GCD. I přesto, že úroveň transientní exprese je v porovnání s expresí pomocí rekombinantních virů vakcinie  nízká,  je dostatečná k odlišení patogenních mutací od polymorfismů. Vzhledem různé účinnosti transfekce však mají aktivity naměřené v různých  experimentech velký rozptyl, proto je žádoucí do každé série měření zařadit normální GCD a známé patogenní mutace. Expresí mutantních proteinů jsme mohli potvrdit patogenitu mutací 72delC, 1326insT, 1263del55, S196P, G202E, T369M, L444P+V460V, D409H+T369M, 1263del60, které doposud nebyly exprimovány.