Závěrečná zpráva grantu 147/1997/C/1.LF

Název projektu:Cytofluorimetrická detekce apoptózy a jejích mechanismů při infekci makrofágů virem vakcinie
Hlavní řešitel:MUDr. Martin Vokurka, CSc.
Spoluřešitelé: MUDr. Zora Mělková, Ph.D.; MUDr. Zuzana Humlová; Mgr. Marie Bartošová
Období řešení:1997-1999
Celková dotace:590 tis. Kč

Souhrn výsledků

Grantový projekt byl zameren na studium apoptózy makrofágu vyvolané virem vakcinie (VV) a jejích mechanismu pomocí prutokové cytometrie. Výsledky byly prubežne prezentovány ve forme plakátových sdelení a k odeslání je pripraven clánek do Journal of Immunology. Projekt byl rešen po dobu 3 let, v prvním roce byla pridelena 1/2 požadovaných prostredku, ve tretím roce 2/3.
1. Vypracování metod detekce casných projevu apoptózy
Byla vypracována metodika cytofluorimetrické detekce apoptózy. Pro apoptózu je charakteristický casný pokles mitochondriálního potenciálu pri nezmenené permeabilite bunecné membrány (která se zvyšuje v prípade sekundární nekrózy). Mitochondriální potenciál jsme stanovovali pomocí fluorescence rhodaminu 123, resp. DiOC6. Propustnost bunecné membrány byla charakterizována pomocí propidium jodidu (PI). Jako další metoda detekce apoptózy byl použit znacený Annexin V, který deteguje na povrchu bunek fosfatidylserin, jehož expozice je jedním ze znaku apoptózy. Zavedli jsme rovnež stanovení aktivity laktátdehydrogenázy (LDH) v médiu. LDH je uvolnována do média pri poškození bunecné membrány (nekróze, ev. však i pri zmene permeability v dusledku infekce VV). Výsledky zmen membránového potenciálu byly korelovány s morfologickými zmenami a typickou degradací DNA (DNA „ladder“).
K vyšetrení korelace apoptózy a infekce VV jsme nechali vyrobit imunizací králíka polyklonální FITC-znacenou protilátku proti VV, jejíž pomocí jsme detegovali pri prutokové cytometrii bunky infikované VV.
2. Studium mechanismu apoptózy
Pomocí výše uvedených metod jsme prokázali, že VV vyvolává apoptózu makrofágu. Oxid dusnatý (NO), který je v makrofázích indukován pusobením IFNgama a zprostredkovává nekteré jejich antimikrobiální funkce, se podílí rovnež na protivirovém pusobení a inhibuje rust VV na úrovni DNA. Vysoké koncentrace NO vedou k cytotoxickým úcinkum a vzniku apoptózy. V infikovaných a stimulovaných makrofázích lze prokázat vyšší produkci NO (stanovením nitritu v médiu). Použití inhibitoru iNOS (aminoguanidin) však v našich experimentech neovlivnovalo apoptózu, i když cástecne bránilo inhibici virového rustu zprostredkované NO. K vyloucení pouze antigenního pusobení VV na vznik apoptózy jsme použili srovnání živého a povareného viru, pricemž procento apoptózy se zvyšovalo jen pri použití živého viru. Použití cytosin-arabinosidu, inhibitoru DNA polymerázy kódované VV, rovnež neovlivnilo procento apoptotických bunek, z cehož usuzujeme, že apoptóza není podmínena expresí pozdních genu VV (k níž je nutná predchozí syntéza virové DNA). Pri infekci VV dochází k ovlivnení rady intracelulárních deju, zejm. inhibici syntézy RNA a proteosyntézy bunecných bílkovin. Podání inhibitoru exprese casných genu VV (aktinomycinu D a cykloheximidu) zvyšuje procento apoptózy i v neinfikovaných bunkách, címž napodobuje pusobení infekce VV. Domníváme se proto, že exprese casných genu VV zpusobující selektivní poruchu syntézy bunecných proteinu (tzv. shut-off fenomén) muže být mechanismem vzniku apoptózy.
Dalšími významnými regulátory apoptózy, úcinkujícími na úrovni mitochondrií, jsou proteiny z Bcl-2 rodiny. Ovlivnení jejich syntézy výše zmíneným mechanismem by mohlo pusobit na viabilitu bunek. V infikovaných makrofázích jsme stanovovali western blotem množství proteinu Bcl-xL, který patrí do rodiny Bcl-2 proteinu a má v makrofázích antiapoptotické pusobení (Bcl-2 nebyl v makrofázích nalezen). Množství Bcl-xL bylo sníženo v infikovaných bunkách již 6 hodin po infekci, exprese proapoptotického Bax nebyla zmenena. Pri infekci rekombinantním virem exprimujícím Bcl-2 v sense orientaci se podarilo pomocí výše uvedených metod pozorovat pokles apoptózy (menší procento bunek se sníženým mitochondriálním potenciálem, menší procento Annexin V-pozitivních bunek). Domníváme se, že pokles antiapoptotického Bcl-xL predstavuje efektorovou fázi apoptózy, zatímco za indukcní fázi je pravdepodobne zodpovedná exprese casných genu VV a inhibice bunecné proteosyntézy.