Závěrečná zpráva grantu 159/1997/C/1.LF

Název projektu:Detekce mutací genu BRCA1 u karcinomu prsní žlázy
Hlavní řešitel:MUDr. Petr Pohlreich, CSc.
Spoluřešitelé: Doc. MUDr. Jaromír Křemen, CSc.; Doc. MUDr. Bohuslav Konopásek, CSc.; Květa Straková; Mgr. Milada Koštířová; MUDr. Jana Stříbrná, CSc.; Michal Zikán
Období řešení:1997-1999
Celková dotace:340 tis. Kč

Souhrn výsledků

Karcinom prsu představující  u žen v Evropě nejčastěji se vyskytující malignitu je v 5 - 10% případů dědičného původu. Charakterizace genů, BRCA 1 a BRCA 2,odpovědných za familiární formy nádorů umožňuje odhalit  v postižených rodinách nosiče mutací. U 81 pacientek z rizikových rodin pražského regionu jsme provedli mutační analýzu, která zahrnovala celou kódující sekvenci genu BRCA 1.Většina pacientek s hereditární formou karcinomu byla zachycena v registru Onkologické kliniky 1. LF UK. Vyšetřovaný genetický materiál byl izolován z periferní krve; zpětnou transkripcí byla z celkové RNA získána cDNA. Sekvence exonu 11, která tvoří přibližně 60% kódující sekvence genu, byla rozdělena na tři překrývající se fragmenty, které byly amplifikovány pomocí PCR na genomové DNA. Zbývající kódující úseky (22 exonů) byly amplifikovány pomocí nested PCR na cDNA. Mutace byly detekovány na úrovni proteinu pomocí tzv. PTT testu (protein truncation test). Prodloužení produktů PCR o T7 promotor a konsensní sekvenci nutnou pro eukaryontní translaci je podmínkou pro jejich transkripci a následnou translaci in vitro.Proteiny syntetizované v přítomnosti značeného methioninu byly následně elektroforeticky rozděleny a detekovány autoradiografií. K charakterizaci mutací a analýze sekvencí exonu 1 - 5 bylo použito cyklické sekvenování příslušných PCR produktů. PTT analýza prokázala čtyři různé mutace způsobující zkrácení proteinového produktu. Tyto mutace zahrnují dvě delece vedoucí k posunu čtecího rámce a dvě nonsens mutace. Důsledkem delece jednoho ze  sedmi A zbytků v úseku 1129 - 1135 (1129delA) je terminace peptidu na kodonu 340; delece AG v místě nukleotidu 2530 (2530delAG) pak ukončuje translaci na kodonu 808. Tranzice C za T na nukleotidech 1806  a 3450 (mutace Q563X a Q1111X) představují  nonsens mutace. Poslední genová alterace byla zachycena přímým sekvenováním a týká se delece celého pátého exonu genu BRCA1 (254del78).