Závěrečná zpráva grantu 166/1997/B-FYZ/PrF

Název projektu:Studium lokalizace a fotofyzikálních vlastností fluorescenční sondy DPH v biologických membránách.
Hlavní řešitel:RNDr. Ivo Konopásek, CSc.
Spoluřešitelé: Doc.RNDr. Jaroslava Svobodová, CSc.; RNDr. Jaroslav Večeř, CSc.; RNDr. Evžen Amler, CSc.; RNDr. Petr Heřman, CSc.; Mgr. Miloš Kalhous; není Šimon Hrozinka; Mgr. Aleš Holoubek; Ondřej Drbohlav; Mgr. Jiří Mašín
Období řešení:1997-1999
Celková dotace:190 tis. Kč

Souhrn výsledků

Souhrn výsledků.
Fluorescenční sonda 1, 6-difenyl-1,3,5-hexatrien  (DPH) a jeho deriváty patří k nejpoužívanějším fluorescenčním sondám, které monitorují pohyblivost membránových komponent. Přestože se přední světové laboratoře zabývají měřením dohasínání fluorescence a anisotropie DPH už více než dvacet let, mnoho základních otázek zůstává nevyřešeno. Literární údaje o dohasínání fluorescence DPH v rozpouštědlech nejsou jednotné a udávají  jak monoexponenciální, tak biexponenciální dohasínání. V anisotropním prostředí biologických membrán  panuje nejednotnost v interpretaci dohasínání krátké komponenty DPH. Zatím nebyla nalezena korelace mezi jejím velikostí, zastoupením a nějakou charakteristickou vlastností membrány. V literatuře existuje několik hypotéz o původu této krátké komponenty v membránách, které nebyly jednoznačně dokázány.
V rámci projektu „Studium lokalizace a fotofyzikálních vlastností fluorescenční sondy  DPH v biologických membránách byly dosaženy následující výsledky:
1) Dohasínání DPH v rozpouštědlech:
Byla měřena škála rozpouštědel rovnoměrně pokrývající široký interval dielektrických konstant a ve všech těchto rozpouštědlech byla zaznamenána krátká komponenta se zastoupením okolo 1% celkové intenzity. Bylo zjištěno, že obě komponenty dohasínání korelují s dielektrickou konstantou.
2) Spektra krátké a dlouhé komponenty v membránách.
Pomocí časově rozlišené fluorescence byla v liposomech ze sojového fosfatidylcholinu změřena spektra DPH příslušející krátké a dlouhé komponentě.  Emisní maximum krátké komponenty bylo posunuto směrem k delším vlnovým délkám. Na základě těchto měření byla vyvinuta hypotéza o populaci DPH lokalizované na periferii membrány, která vzhledem ke své lokalizaci dohasíná rychleji.
3) Ovlivnění  velikosti  krátké komponenty rezonančním přenosem energie z DPH na akceptor.
Jako akceptor jsme použili molekulu FITC (fluorescein-isothiokyanát)  kovalentně navázanou  na molekulu hovězího sérumalbuminu. Měření ukázala, že je preferenčně ovlivněna krátká komponenta, což potvrdilo naši hypotézu (viz bod C).
4)  Fotodegradace a dimerizace molekul DPH  a podíl krátké komponenty v membránách.
Dokázali jsme, že v našich podmínkách nemůže být zdrojem krátké komponenty ani fotodegradace, ani dimerizace molekul DPH.
5) Dohasínání DPH a jeho derivátu v membránách.
V membránách různého složení  jsme měřili dohasínání DPH a TMA-DPH s důrazem na velikost a podíl krátké komponenty. Dokázali jsme, že změny velikosti krátké komponenty, jejíž podíl dosahuje 5-10%, korelovaly se změnami dlouhé komponenty. Krátká komponenta byla přitom ovlivnitelná  jak složením membrány, tak teplotními změnami, fázovými přechody i působením alkoholů.
6) Dohasínání  DPH a TMA-DPH v membránách při fázovém přechodu indukovaném alkoholem. V teplotě těsně pod fázovým přechodem indukují alkoholy fázový přechod. Dokázali jsme, že změny krátké a dlouhé doby života v těchto podmínkách nejsou vzájemně korelované, což ukazuje na využitelnost krátké komponenty dohasínání k monitorování účinku membránově aktivních látek na membránovou strukturu.