Závěrečná zpráva grantu 167/1997/B-CH/FaF

Název projektu:	Určení stereoselektivity a stereospecifity biotransformačních enzymů potenciálního protizánětlivého léčiva flobufenu
Hlavní řešitel:	Doc. Ing. Vladimír Wsól, Ph.D.
Spoluřešitelé:	Prof. RNDr. Eva Kvasničková, CSc.; Alena Pakostová; PharmDr. František Trejtnar, CSc.; Ing. Barbora Szotáková; RNDr. Lenka Skálová, Ph.D.; Mgr. Radim Král; Andrea Navarová; Hana Cepková; Prof. Anthony F. Fell; Lucie Bimková
Období řešení:	1997-1999
Celková dotace:	450 tis. Kč

Souhrn výsledků

Projekt 167/1997/B/CH řešený v letech 1997-1999 byl zaměřen především na vývoj nových analytických separačních metod pro dělení chirálních látek a charakterizaci příslušných biotransformačních enzymů při kontaktu s chirální molekulou potenciálního protizánětlivého nesteroidního léčiva flobufenu. Biotransformační studií u běžných laboratorních druhů (myš, potkan, morče, králík, pes a miniprase) bylo zjištěno, že je flobufen přeměňován převážně na 4-dihydroflobufen, tedy metabolit s dvěmi centry chirality.
Analytická část projektu byla zaměřena na hledání vhodné metody pro stanovení všech 4 možných stereoizomerů 4-dihydroflobufenu a dvou enantiomerů vedle sebe. K separaci byla vybrána vysokoúčinná kapalinová chromatografie a pro dělení chirálních směsí byl chirální selektor ukotven jako chirální stacionární fáze (CSP). Postupně byly testovány různé typy CSP a zkoušeny různé techniky ON-LINE a OFF-LINE separací. Během testování všech základních komerčně dostupných typů CSP a po různých optimalizačních procedurách se ukázalo, že nelze v jediném nástřiku vedle sebe stanovit všech šest enantiomerů a diastereoizomerů, takže byla vyvinuta zvlášť metoda pro stanovení enantiomerů flobufenu a metoda pro stanovení diastereoizomerů 4-dihydroflobufenu. Pro dělení enantiomerů flobufenu byla vybrána kolona s allyl-terguridem jako stacionární fází a nejlepší separační účinnost pro dělení diastereoizomerů 4-dihydroflobufenu vykazovala CSP Pirklova typu ULMO. Pro cílené stanovení jednotlivých forem flobufenu a jeho hlavního metabolitu v biologickém materiálu musely být díku rušivým vlivům biologických matric metodiky znovu optimalizovány.
Na základě metabolických studií se ukázalo, že se člověk svou metabolickou přeměnou flobufenu in vivo odlišuje od ostatních živočišných druhů. U běžných laboratorních zvířat se in vivo flobufen přeměňuje přes 4-dihydroflobufen až na příslušný derivát kyseliny octové, kdežto u člověka se metabolická přeměna zastaví u 4-dihydroflobufenu. Morče, jako jediné z běžně dostupných laboratorních species, vytváří in vivo oba metabolity, 4-dihydroflobufen i derivát kyseliny octové. Na základě těchto experimentů byly další srovnávací studie prováděny na úrovni in vitro u potkana, morčete a u člověka. U všech tří druhů byla stanovena stereoselektivita a stereospecifita příslušných biotransformačních enzymů. Z experimentů je zřejmé, že obdobnou stereoselektivitu a stereospecifitu biotransformačních enzymů vykazuje potkan a člověk, zatímco enzymová výbava morčete přeměňuje flobufen odlišným způsobem.
Informace o stereoselektivitě a stereospecifitě různých biotransformačních enzymů získané při řešení tohoto projektu budou doplněny dalšími studiemi s jinými chirálními a prochirálními substráty. Na podkladě většího souboru informací pak bude možno výsledky zobecnit a podle typu chirálního substrátu také navrhnout nejvhodnější model pro testování takových látek. Znalost vhodného modelu pak nejen zefektivní finanční náročnost prováděných studií, ale v konečném důsledku mnohdy odhalí možné nežádoucí účinky konkrétního enantiomeru a umožní včasnou alternativní změnu.