Závěrečná zpráva grantu 182/1997/B-CH/PrF

Název projektu:Studium molekulárního mechanizmu glykace polymerů a krevních glykoproteinů jako modelových sloučenin některých patologických procesů
Hlavní řešitel:RNDr. Zdeněk Pavlíček, DrSc.
Spoluřešitelé: Eva Šobrová; Doc.RNDr. Vladimír Karpenko, CSc.; Doc.RNDr. Jiří Vohlídal, CSc.; Doc.RNDr. Milan Kodíček, CSc.; Mgr. Robert Zoulík; Ettrich Rüdiger; Mgr. Tomáš Obšil, Dr.; Miroslav Štěpánek; Kateřina Hofbauerová; Michal Hanus; Tomáš Otcovský
Období řešení:1997-1999
Celková dotace:300 tis. Kč

Souhrn výsledků

1. Pro studium molekulárního mechanismu glykace byla užita jako modelová látka syntetický kopolymér na bázi amidu kyseliny polymethylakrylové a lidský serumalbumin. Tyto látky byly inkubovány  glykolaldehydem po dobu168 hodin. Produkty glykace byly oxidovány atmosférickým  kyslíkem za přítomnosti křenové peroxidázy. Výsledkem   byla generace elektronově excitovaných stavů, vedoucí k chemiluminiscenci produktů. Chování syntetického kopolyméru a lidského serumalbuminu bylo  konfrontováno   na základě chemiluminiscenčních dat. V obou případech  byl  u chemiluminiscence zjištěn dvoufázový charakter. Byl navržen mechanismus, který může vysvětlit vznik elektronově excitovaných molekul. Excitační energie může být  přenesena na kyslík a vytvořit tak reaktivní formy kyslíku (singletový kyslík, superoxidový radikál aj.)
2. V rámci tohoto projektu byla studována možnost, že  glykace aminofosfolipidů v lipidické  membráně ovlivňuje aktivitu a strukturu Na,K-ATPasy, vázané v membráně. Bylo zjištěno, že jak glukosa, tak glyceraldehyd   reagují s fosfolipidy a tvoří glykofluorofóry. Efekt  glykace aminofosfolipidů na uspořádání a hydrataci lipidické dvojvrstvy  byl studován  časově rozlišenou   fluorescencí. Inhibice  aktivity  Na,K-ATPasy v průběhu glykace byla výsledkem zvýšené uspořádanosti   a změny permitivity   v membráně.
3. Bylo zjištěno, že lidský haptoglobin, patřící do skupiny krevních glykoproteinů, má chaperonovou aktivitu. Ta se projevuje inhibicí   tepelně vyvolané agregace katalázy a g -krystalinu. Navíc haptoglobin vykazoval ochranný účinek proti inaktivaci   katalázy, způsobené   glykací  glyceraldehydem. Chaperonová aktivita haptoglobinu se zmenšuje v průběhu   jeho glykace.
4. Úloha cukerné složky bílkovin pro stabilitu bílkovinné molekuly byla studována na lidském orosomukoidu. Byly připraveny modifikované formy molekuly orosomukoidu, do různého stupně  zbavené buď celé cukerné složky nebo pouze kyseliny sialové. Výzkum byl prováděn  měřením UV-spektroskopie (absorpční spektra a jejich čtvrtá derivace, teplotně perturbační diferenční spektra), cirkulárního dichroismu a fluorescence.
Jak se ukazuje, všechny modifikace vedou u orosomukoidu k tvorbě kompaktnější struktury, což se projevuje rostoucím počtem pohřbených   ultrafialových chromofórů (Trp). Současně klesá poněkud obsah a-helixů a
b -struktury, zatímco narůstá obsah ohybových a aperiodických struktur. Ukazuje se, že odstranění jednoho  z pěti   cukerných zbytků má mnohem větší efekt na strukturu orosomukoidu, než kompletní desialysace  tohoto proteinu.