Závěrečná zpráva grantu 239/1997/C/1.LF

Název projektu:Studium posttranskripční regulace mitochondriální ATP-syntázy
Hlavní řešitel:Mgr. Hana Antonická
Spoluřešitelé: RNDr. Zdeněk Drahota, DrSc.; MUDr. Josef Houštěk, CSc.; Ing. Jana Heřmanská
Období řešení:1997-1999
Celková dotace:518,5 tis. Kč

Souhrn výsledků

            Cílem projektu bylo studium regulačních mechanizmů, které se uplatňují při kontrole biogeneze mitochondriálních enzymů oxidační fosforylace. Projekt byl specificky zaměřen na ověření hypotézy, že se na regulaci biosyntézy klíčového enzymu tvorby ATP v buňce, mitochondriální ATP-syntázy, podílí postranskripční mechanizmy ovlivňující stabilitu a translační účinnost mRNA pro ATPázové podjednotky pomocí specifických mRNA-vazebných proteinů. Jako modelový transkript pro studium předpokládaných mRNA-vazebných proteinů byla vybrána mRNA podjednotky beta (dále beta-ATPáza), která je hlavní katalytickou podjednotkou enzymu.
         Vyklonovali jsme myší cDNA pro beta podjednotku ATPázy. Pomocí automatické sekvenace byla určena sekvence, která byla přijata do GenBank databáze (AC:AF030559). Dále byly připraveny další cDNA pokrývající 3´netranslatovaný konec beta-ATPázy, pomocí kterých byly připraveny radioaktivně značené RNA.
         Zkoumali jsme existenci cytosolárních faktorů z různých myších tkání, které reagují s mRNA pro beta podjednotku. Na základě vazebných esejí, EMSA (electrophoretic mobility shift assays) a cross-linkování RNA a proteinů pomocí UV, jsme ukázali přítomnost dvou RNA-proteinových komplexů s molekulovou hmotností 115 kDa a 75 kDa. Odpovídající proteiny byly nazvány BARB1 a BARB2 (t.j. Beta ATPase mRNA-Binding Protein). Oba proteiny selektivně interagovaly s 3´netranslatovanou oblastí mRNA pro beta-ATPázu. Jeden z proteinů, BARB1, je nový poly(A) vazebný protein, který se specificky váže na poly(A) konec mRNA pro beta-ATPázu. Specifita této vazby je dosažena pomocí interakce s druhým proteinem, BARB2, který se váže na U-bohatou oblast v mRNA pro beta-ATPázu. Naopak, v nepřítomnosti BARB1 proteinu, BARB2 je stále schopen vázat se na mRNA pro beta-ATPázu, ale s mnohem menší intensitou. Na základě dvourozměrné elektroforézy a „northwestern“ analýzy jsme ukázali, že BARB1 a BARB2 proteiny spolu interagují in vivo, a společně s mRNA pro beta-ATPázu tvoří trimerní komplex.
          Vazba BARB proteinů na mRNA pro beta-ATPázu je specifická i tkáňově. Vysokou vazebnou aktivitou jsme nalezli v mozku, nižší v srdci, ledvinách a játrech, nízkou v hnědém tuku a v plicích. Tkáňová specifita vazby těchto dvou proteinů významně ukazuje na postranskripční regulaci množství syntetizované beta podjednotky ATPázy v různých tkaních, kde přítomnost BARB proteinů zřejmě zvyšuje translační účinost.
         Výsledkem experimentů uskutečněných v rámci projektu je potvrzení přítomnosti mRNA vazebných proteinů, BARB1 a BARB2, vázajících se selektivně na mRNA pro beta-ATPázu dosud nepopsaným vzájemně závislým způsobem. Komplex těchto dvou proteinů se pravděpodobně podílí na posttranskripční regulaci.
          Další studie, zaměřené na izolaci a charakterizaci BARB proteinů budou důležitým krokem v pochopení funkce těchto proteinů v posttranskripční regulaci biosyntézy ATP syntázy.