Souhrn výsledků
1. Dostatečná koncentrace
draselných iontů je nezbytnou podmínkou adaptace Bacillus subtilis na osmotický šok.
I když je známa sekvence genomu této bakterie, nelze na základě homologie vybrat
vhodnou sekvenci, která by kódovala předpokládaný transportní system pro draselné
ionty. Pokusili jsme se tento system mutovat (transposonovou i UV mutagenesí). Podařilo
se nám získat skupinu mutant, která vyžadovala vyšší koncentrace draselných iontů
pouze při teplotách nad 33°C, byla osmosensitivní při nízkých koncentracích
draselných iontů a současně tvořila spory, které špatně klíčily při nízkých
koncentracích draselných iontů, ale i při teplotách nad 33°C. Při vegetativním
růstu za nízkých teplot (28°C) však tyto mutanty neměly podstatně vyšší nároky
na koncentraci draselných iontů než kmen divokého typu.
Abychom vyloučili isolaci této skupiny nežádoucích mutant s komplexními vlastnostmi,
použili jsme pro další mutagenesi asporogenní kmen (spo0E) a získali jsme
inserční mutagenesí minitransposonem Tn10 mutanty, které vyžadují vysoké
koncentrace draselných iontů, jak pro růst, tak i pro osmoregulaci. Vzhledem k tomu ,
že inserční mutagenese inaktivuje zasažený gen, musí B.subtilis kódovat ještě
alespoň jeden další transportní system pro K+ ionty. Získané
mutanty jsme charakterizovali z hlediska nároku na draselné ionty, jak pro růst tak pro
úspěšnou adaptaci na hyperosmotický šok. Zasažený gen budeme v budoucnu
identifikovat parciálním sekvenováním s využitím primerů se stejnou sekvencí jako
mají známé konce insertovaného minitransposonu.
2. Prokázali jsme, že B.subtilis syntetizuje
vedle prolinu velká množství alespoň dvou dalších osmoprotekčních látek v reakci
na hyperosmotický šok. Akumulované intracelulární osmolyty jsme purifikovali
pomocí TLC, LC a elektroforesy doplněné ve druhém směru chromatografií.
Purifikované látky jsme charakterisovali specifickým barvením chromatogramů.Obě se
chovají jako primární aminy, z nichž jeden má rovněž karboxylovou skupinu a
tři kumulované hydroxylové skupiny. Chromatografické chování těchto látek se
lišilo od všech známých biogenních aminokyselin, základních polyaminů a
aminocukrů. Struktura bude muset být určena hmotnostní spektrometrií. Akumulace
osmoprotektans trehalosy nebyla u B. subtilis prokázána.
3. Prokázali jsme, že adaptace B.subtilis na
podmínky vysoké osmolarity vede k sensibilisaci těchto buněk k letálnímu působení
přirozených iontových detergentů - derivátů kyseliny cholové (přítomných v
žluči obratlovců). Vyšší sensibilisace vzniká po působení iontového osmolytu
(NaCl) než neiontového (glukosa). Přirozený exogenní osmoprotektans glycinbetain (v
přírodě získávaný z lysovaných eukaryontnich buněk) tuto sensibilisaci podstatně
zvyšuje. Z uvedeného vyplývá, že adaptace B.subtilis na hyperosmotický šok vede
nejen ke zvýšení intracelulární koncentrace některých specifických kompatibilních
osmolytů a k indukci synthesy šokových proteinů, ale i ke změnám cytoplasmatické
membrány, které se stávají citlivější k působení detergentů. |