Závěrečná zpráva grantu 254/1997/B-BIO/PrF

Souhrn výsledků

Projekt byl zaměřen na studium tvorby a vývoje morfologie kvasinkových kolonií a jejich chování, jako modelu organisované vícebuněčné struktury:
    1) Získali jsme výsledky ukazující na existenci signálů na dlouhou vzdálenost mezi jednotlivými kvasinkovými koloniemi rostoucími na pevném agarovém médiu a tyto signály jsme částečně charakterizovali. Jako jedna ze signálních komponent byl identifikována amoniak, který je koloniemi produkován v pulsech. (Palková et al., Nature 390: 532-536, 1997) Dále jsme zjistili, že  a) produkce NH₃ je závislá na přítomnosti a transportu určitých aminokyselin do buněk během růstu kolonií; b) Mep2 permeasa a G-protein Gpa2, jejichž role při "sensingu" extracelulární koncentrace NH₄⁺ iontů v procesu přepínání Saccharomyces cerevisiae z "kvasinkovitého" na pseudohyfální růst byla nedávno zjištěna, se neuplatňují v NH₃ systému u kolonií. c) NH₃ (produkovaný partnerskou kolonií nebo z arteficiálního zdroje) indukuje intensivní produkci NH₃ u okolních kolonií nezávisle na jejich fázi růstu a vyvolá tak synchronisaci NH₃ pulsů u celé "populace" kolonií. "Přechod" kolonií Candida mogii do fáze intensivní produkce amoniaku je provázen výraznými změnami v morfologie kolonií i v morfologii a růstu buněk.   (Palková,Z., Forstová,J., J. Cell. Sci., přijata k publikaci, 2000); d) gradienty NH₄Cl ani NaOH nevyvolají NH₃ produkci u exponovaných kolonií. Na základě získaných výsledků předpokládáme, že aktivní komponentou v NH₃ signálním systému u kvasinkových kolonií je neprotonisovaný NH₃, který proniká do buněk difusí a může ovlivňovat pH vnitrobuněčných kompartmentů (vakuol). Mechanismus působení NH₃ na kvasinkové buňky by mohl být proto podobný tomu, který byl již dříve navržen pro Dictyostelium discoideum (Davies et al., Cell 75: 321-327, 1993) .  
    2) Isolovali jsme a pomocí tetrádové analysy charakterisovali dvě nové mutanty Saccharomyces cerevisiae s poruchou ve signálním NH₃ systému. Identifikace genů, nesených plasmidy získanými komplementační analysou mutant (s využitím kvasinkové genomové knihovny), probíhá v současné době.
    3) Zavedli jsme a úspěšně použili nový metodický přístup, který nám umožňuje široké vyhledávání a isolaci genů, jejichž exprese se mění v průběhu morfogenese kolonií kvasinek S.cerevisiae. Do současné doby jsme získali a identifikovali šest takových genů: i) ORF YDR325W kódující protein o dosud neznámé funkci; ii) CCR4 kódující transkripční regulační protein; iii) MEP3 kódující vysokokapacitní/ nízkoafinitní permeasu transportující NH₄⁺ do kvasinkových buněk; iv) ADE5/7 kódující glycinamide ribotide synthetasu a aminoimidazole ribotide synthetasu, ktera hraje roli při biosynthese adeninu; v) CAT2 kódující carnitine O-acetyltranferasu a vi) PAM1 kódující vysokokopiový supresor ztráty Pp2a fosfatasy. Expresi jednotlivých genů v kvasinkových koloniích sledujeme za různých růstových podmínek.