Závěrečná zpráva grantu 256/1997/B-BIO/PrF

Název projektu:Detekce kreatinkinázy v myofibrile svalu
Hlavní řešitel:Prof. RNDr. Jiří Mejsnar, DrSc.
Spoluřešitelé: RNDr. Jarmila Šavlíková, CSc.; Jana Klimentová; RNDr. Bohumír Štefl, CSc.; Doc. RNDr. Jaromír Plášek, CSc.; Mgr. Jitka Žurmanová; Mgr. Alena Janovská, Ph.D.; Mgr. Martin Gregor
Období řešení:1997-1999
Celková dotace:330 tis. Kč

Souhrn výsledků

    Na myofibrily vázaná kreatinkináza (CK) byla vybrána jako model ke studiu energetických transformací a biofysikálního chování enzymu za definovaných strukturálně-funkčních vztahů.
    Byly zavedeny 3 metody přípravy "skinned fibers" krysího m. psoas. Na těchto vláknech byly změřeny topografické vzdálenosti na subcelulárních strukturách pomocí optické a elektronové mikroskopie (4). Jako srovnávací standard aktivity byla stanovena CK aktivita mitoplastů (1).
    Připravili jsme čistou myofibrilární frakci a standardisovali  měření její CK aktivity (2). Za použití polyakryl- amidové elektroforézy byly detekovány molekuly CK a měřena jejich enzymatická aktivita (3).
    Kvantitativní stanovení CK aktivity na fysiologicky funkční subcelulární struktuře myofibril je komplikováno efektem "substrate channelling". Velikost efektu způsobeného myosinovou ATPasou za použití dvou komplementárních metod přesahuje 50% úbytku fosfokreatinu a vyčísluje tak "chybu", se kterou se stanovuje aktivita enzymu (5). Pokusy ukazují omezenou možnost biochemických metod ke stanovení aktivity CK přechodem na subcelulární a na molekulární úroveň (7).
    Aktivita CK je měnitelná konformačními změnami molekuly enzymu. K měření konformačních změn byla zavedena metoda FRET (fluorescence resonance energy transfer). Molekula CK byla označena donorem IAF a akceptorem ErITC. Po excitaci ve 494 nm byl měřen Foersterův energetický přenos. Emise fluorescence registrovaná v 505-570 nm indikovala délkovou změnu způsobenou konformační změnou molekuly ve dvou sledovaných stavech. Použitá dvojice fluorofor však snižuje enzymatickou aktivitu obsazením aktivního místa molekuly (6). Pokusy pokračují výběrem jiných fluorofor.
Publikace:
1. Gregor M., J.Mejsnar,A.Janovská: Muscle energetics at the molecular level. Arch.Physiol.Biochem.105:275,1997.
2. Gregor M.,J.Mejsnar,A.Janovská: Creatine-kinase activity detection in myofibrils from rat psoas muscle. J.
   Physiol. (London) 511: 154P-155P, 1998.
3. Gregor M.,J.Mejsnar, A.Janovská: Polyacrylamine gel electrophoresis of the myofibrillar-bound creatine kinase.
   Physiol. Res. 47: 17P, 1998.
4. Mejsnar J., M. Gregor, O. Benada, B. Mejsnarová: Light and electron microscope examination of skinned fibers
   of rat psoas with respect to their CK activity. Physiol. Res. 47: 18P, 1998.
5. Gregor M., J. Mejsnar, A. Janovská, J. Žurmanová, O. Benada, B. Mejsnarová: Creatine kinase reaction in
   skinned  rat psoas muscle fibres and their myofibrils. Physiol. Res. 48: 27-35, 1999.
6. Mejsnar J.A., M. Gregor, E. Amler, J.Plášek: Enzyme catalytic activity due to changes in molecular conformation.
   Physiol. Res. 48: S95, 1999.
7. Mejsnar J., A. Janovská, R. Blatný, M. Gregor, J. Šavlíková, B. Štefl: Enzymatic reaction and the enzyme activity
   assessed at a subcellular level. Physiol. Res. - in press.