Závěrečná zpráva grantu 264/1997/B-BIO/PrF

Název projektu:Účinek alkoholů na strukturu a dynamiku bakteriální membrány
Hlavní řešitel:Doc.RNDr. Jaroslava Svobodová, CSc.
Spoluřešitelé: RNDr. Jiří Janeček, CSc.; RNDr. Josef Náprstek, CSc.; RNDr. Ivo Konopásek, CSc.; Ing. David Nekolný; Mgr. Miloš Kalhous; Šimon Hrozinka; Mgr. Ondřej Toman; Radmila Pustějovská; Jiřina Loucká; Denisa Petráčková
Období řešení:1997-1999
Celková dotace:240 tis. Kč

Souhrn výsledků

                                    SOUHRN DOSAŽENÝCH VÝSLEDKÚ
1) Bakterie Bacillus subtilis roste v komplexním mediu při teplotě 40 °C  s dobou zdvojení 16 minut. Při poklesu kultivační teploty ze 40 na 20°C (chladový šok) dochází v této bakterii k zastavení růstu na  80 minut. Poté se ustaluje nová rovnováha, odpovídající růstové teplotě 20°C a bakterie pokračuje v růstu s dobou zdvojení 120 minut. Přidání ethanolu do kultivačního media před chladovým šokem  prodlužuje 80 minutovou zástavu růstu, a tedy ztěžuje adaptaci na nízkou teplotu, benzylalkohol interval 80 minut zkracuje, a tedy patrně napomáhá přizpůsobení se poklesu teploty.
2) Efekt obou alkoholů na stav cytoplasmatické membrány byl studován pomocí rovnovážné anisotropie fluorescence a analysou distribuce dob života excitovaného stavu difenylhexatrienu (DPH) a jeho polárního derivát, TMA-DPH. Stanovení anisotropie fluorescence naznačovalo podobný účinek obou alkoholů na membránu B.subtilis – ztekucení. Podstatný rozdíl však vyplynul z analysy distribuce lifetimes  DPH  v přítomnosti oboualkoholů :  benzyl alkohol významně zkracoval dlouhou komponentu doby života DPH a rozšiřoval jeho distribuci, zatímco ethanol nevykazoval měřitelný efekt. Aktivita benzylalkoholu byla interpretována jako zvýšení hydratace membrány v důsledku poklesu uspořádanosti membránové struktury.  Takovýto účinek je podobný odpovědi bakterie na chladový šok – synthese nenasycených mastných kyselin.
3) Analysa mastných kyselin membránových fosfolipidů ukázala, že ethanol brání výše   
     zmíněnou adaptivní synthesu mastných kyselin. Jestliže pak tento alkohol současně
     vyvolává minimální změny v membráně ( v její uspořádanosti), pak nemůže nahradit
     fyziologickou odpověď jako benzylalkohol.
Výše zmíněná pozorování indikují, že adaptace fyzikálního stavu membrány se
     významně podílí na adaptaci bakterie na chladový šok.
4)   Analysa membránových bílkovin B.subtilis vystaveného chladovému šoku, pomocí
     polyakrylamidové gelové elektroforesy, prokázala existenci nových, chladem
     indukovaných proteinů, s relativními molekulovými hmotnostmi v rozmezí 27 – 14 tis.
     Naopak se snižuje produkce některých vysokomolekulárních proteinů , s Mr nad 93 tis.
5) Jedním ze sensorů chladového šoku na membráně B.subtilis je nespecifická proteinkinasa o Mr 94 tis., která zesiluje svou fosforylaci v přítomnosti ethanolu v kultivačním mediu. Současně však bylo prokázáno dvojrozměrnu elektroforesou bílkovin,  že zvýšená fosforylace není důsledkem zvýšené  synthesy tohoto proteinu.
6) Chromatografie fosforylovaných aminokyselin připravených kyselou hydrolysou fosforylovaného proteinu naznačuje, že aminokyselinovým zbytkem, který je cílem enzymové kovalentní modifikace není ani serin, ani treonin.
7) Z výše uvedených výsledků vyplývá, že alkoholy  působí přímo na úrovni membrány, na
      její dynamiku i strukturu; že však je signál o jejich přítomnosti přenášen prostřednictvím
      membránových proteinů i do cytoplasmy.