Závěrečná zpráva grantu 309/1997/C/1.LF

Název projektu:Využití fluoroforu JC-1 ke studiu membránového potenciálu vnitřní mitochondriální membrány u pacientů s defekty oxidační fosforylace
Hlavní řešitel:Mgr. Daniel Floryk, Ph.D.
Spoluřešitelé: MUDr. Josef Houštěk, CSc.; MUDr. Jiří Zeman, CSc.; Mgr. Karel Drbal; MUDr. Petr Klement
Období řešení:1997-1999
Celková dotace:363 tis. Kč

Souhrn výsledků

           Jednou z příčin mitochondriálních poruch jsou defekty enzymů oxidativní fosforylace a ATPsyntasy, které mají původ v mutacích mitochondriální nebo jaderné DNA. Mnoho defektů bylo charakterizováno na úrovni genetické nebo biochemické. Velmi málo je známo o vlivu mutací na membránový potenciál vnitřní mitochondriální membrány DY.
       Hlavním cílem tohoto projektu bylo popsat, jak zhoršená funkce některého z OXPHOS enzymů ovlivní velikost mitochondriálního DY. Ke studiu byly použity fibroblasty pacientů s defekty cytochrom c oxidasy (MERRF mutace nt-8344) a od nich odvozené cybridy s definovaným procentuálním zastoupením MERRF mutace (heteroplazmie) a fibroblasty s defektem ATPsyntasy s jaderně lokalizovanou mutací. K měření DY byly použity různé fluorescenční sondy, rhodamin 123 a jeho deriváty TMRM a TMRE, JC-1, safranin) za použití těchto  fluorescenční technik: fluorescenční mikroskopie, spektrofluorometrie a průtoková cytometrie.
       Ve snaze získat reprodukovatelné výsledky, byla vypracována nová metoda pro cytofluorometrickou analýzu DY digitoninem permeabilizovaných buněk za použití TMRM. Byly nalezeny optimální podmínky pro permeabilizaci plazmatické membrány buněk, aniž by došlo k narušení mitochondriální membrány. Permeabilizace buněk digitoninem pak umožňuje použití nanomolární koncentrace fluorescenční sondy, která neovlivní oxidativní fosforylaci. Permeabilizací je zajištěno, že je analyzován pouze signál vycházející z mitochondrií, a sonda neni zadržována v cytosolu po přidání látek ovlivňujících membránový potenciál (rozpřahovače-FCCP, valinomycin). Tento systém také umožňuje studium procesů generujících a disipujících mitochondriální DY pomocí FCCP titrace.
       Byly nalezeny rozdíly v energizaci mitochondriální membrány ve fibroblastech s defektem ATPsyntasy a cytochrom c oxidasy. Buňky s defektem ATPsyntasy měly o 17% vyšší DY než kontrolní buňky. Tento výsledek ukazuje na hyperpolarizaci vnitřní mitochondriální membrány. Buňky s COX defektem měly o 50% nižší DY než kontroly. FCCP titrace ukázala, že DY v COX defektních buňkách byl labilnější oproti kontrolám.
       Měření na připravených klonech s rozdílným zastoupením MERRF mutace ukázala jasný vztah mezi heteroplazmií a velikostí mitochondriálního DY a sníženou COX aktivitou.
        Získané výsledky byly publikovány v Bioscience Reports, Biochemical Journal a Chemical Papers a staly se základem dizertační práce hlavního řešitele.