Závěrečná zpráva grantu 049/2000/C/2.LF

Název projektu:Exprese Na transportních systémů v enterocytech tračníku a role kortikosteroidů
Hlavní řešitel:Ing. Martina Pletichová
Spoluřešitelé: Prof.MUDr. Jan Herget, DrSc.; RNDr. Jiří Pácha, DrSc.; Mgr. Sergej Beskid
Období řešení:2000-2001
Celková dotace:221 tis. Kč

Souhrn výsledků

Kmenové buňky u báze střevní krypty produkují buňky, které migrují podél osy krypta-klk (krypta-povrch tračníku).Tato migrace je spojena s diferenciací enterocytů a s prostorovou segregací jejich vlastností. Cílem projektu proto bylo studium prostorové distribuce různých fenotypů enterocytů podél osy krypty, tj. studium závislosti jejich fenotypu na stupni diferenciace. Zvláštní pozornost byla věnována Na/H antiportu a jeho regulaci kortikoidními hormony. Izolované enterocyty nebo individuálně disekované Lieberkuhnovy krypty byly studovány pomocí kyvetového fluorometru nebo mikrofluorometricky s využitím analýzy obrazu. Jako fluorescenční barvivo byl používán pH indikátor 2,7-bis(2-karboxyetyl)-5(6)-karboxyfluorescein (BCECF) a Ca indikátor Fura-2. Elektrogenní vlastnosti krypt byly studovány pomocí terčíkového zámku v konfiguraci "z celé buňky" a draslíkový proud (IK) byl monitorován v buňkách ekvilibrovaných se 130 mM draslíkem v pipetě. Zjistili jsme, že čerstvě izolované enterocyty distálního tračníku potkana exprimují Na/H, H/K a Na-dependentní Cl/HCO3 antiporty a že tyto přenašeče odstraňují z buňky kyselou nálož . Alkalická nálož je odstraňována Na-independentním  Cl/HCO3 antiportem. Schopnost enterocytů distálního tračníku udržet konstantní intracelulární pH (pHi) byla prokazatelně nižší než u kolonocytů z proximálního tračníku a tento rozdíl byl dán nižší pufrační kapacitou enterocytů v distálním tračníku. Aktivita Na/H antiportu v izolovaných kryptách byla kalkulována jako rychlost návratu pHi z kyselé zátěže. Odstranění externího Na způsobilo reversibilní acidifikaci, přičemž  návrat ke kontrolnímu pHi byl závislý na Na a byl blokovatelný amiloridem. Amilorid v koncentraci 0,1 mM zcela inhiboval Na-dependentní návrat pHi u báze a ve středu krypty, zatímco u ústí krypty byla inhibice pouze částečná. Totální inhibice zde bylo dosaženo teprve při koncentraci amiloridu 1,0 mM. Tento nález ukazuje, že v nejvíce diferencovaných enterocytech ústí krypt je exprimována méně citlivá isoforma Na/H antiportu (NHE3), zatímco na amilorid citlivější isoformy (NHE1, NHE2) jsou exprimovány podél celé krypty. Pomocí RT-PCR provedených na jednotlivých kryptách jsme prokázali mRNA pro všechny tři zmiňované isoformy. Inhibice periferního metabolismu glukokortikoidů karbenoxolonem (inhibitor dehydrogenázy 11beta-hydroxysteroidů) snížila Na-dependentní rychlost návratu ke kontrolnímu pHi jak v diferencovaných, tak i v proliferujících buňkách. To naznačuje, že kortikosteron je schopen při blokádě sveho katabolismu operovat jako mineralokortikoid. Inhibiční efekt mineralokortikoidů na Na/H antiport jsme prokázali rovněž na úrovni NHERF2 (NHE-regulatory protein). Výrazné rozdíly v distribuci transportních proteinů jsme pozorovali nejen u Na/H antiportu, ale i u H/K výměny (H,K-ATPáza). Na draselných iontech závislou intracelularní alkalinizaci jsme pozorovali podél celé krypty, ale aktivita tohoto transportu byla signifikantně vyšší u diferencovaných buněk ústí krypt.Gradient podél krypty byl rovněž pozorován v distribuci IK. Když byl membránový potenciál buňky +60 mV, průměrný IK na buňku byl cca o 60 % vyšší u diferencovbaných buněk ve srovnání s buňkami proliferujícími. Oproti tomu mediátory vyvolávající střevní sekreci jako jsou ATP a bethanechol (acetylcholin) vykazovaly výrazný efekt na buňkách báze krypt, zatímco u buněk středu a ústí krypt byl tento efekt nižší. Závěrem je možné shrnout, že v kryptách distálního tračníku existují podél osy krypty výrazné rozdíly v transportních vlastnostech enterocytů a že tyto rozdíly odrážejí do značné míry stupeň diferenciace buňky.