Závěrečná zpráva grantu 076/1999/C/1.LF

Název projektu:Detekce cirkulujících melanocytů u maligního melanomu jako markeru progrese onemocnění
Hlavní řešitel:MUDr. Jana Stříbrná, CSc.
Spoluřešitelé: Doc.MUDr. Jaromír Křemen, CSc.; Květa Straková; MUDr. Petr Pohlreich, CSc.; MUDr. Ivana Krajsová; MUDr. Zdeněk Kleibl; Michal Zikán; Marie Epsteinová
Období řešení:1999-2001
Celková dotace:310 tis. Kč

Souhrn výsledků

Přítomnost cirkulujících nádorových buněk v periferní krvi naznačuje šíření maligního procesu krevní cestou. Monitorování diseminace nádorových buněk má proto prognostický význam. Techniky detekce nádorových buněk jsou založeny na průkazu enzymů nebo antigenů asociovaných s těmito buňkami pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR). Jedním z nejvíce sledovaných markerů maligního melanomu je enzym tyrosináza, exprimovaný pouze v melanocytech a melanomových buňkách. Protože melanocyty nejsou v krvi přítomny, průkaz tyrosinázové mRNA ukazuje na přítomnost nádorových buněk. Melanom se vyznačuje značnými rozdíly v expresi nádorově specifických proteinů, což limituje spolehlivost testu, založeném na průkazu jediného markeru.
Sledovali jsme expresi tyrosinázy a antigenů specifických pro melanomové buňky MART1 (melanoma antigen recognised by T cells) a MIA (melanoma inhibitory activity) u 37 pacientů s histologicky ověřeným kožním a 74 pacientů s očním maligním melanomem. Pro analýzu bylo použito 5 ml nesrážlivé krve. Frakce mononukleárních buněk byla získána gradientovou centrifugací. Celková RNA byla izolována z této frakce quanidinisothiokyanát-fenolchloroformovou metodou. RNA byla převedena reverzní transkripcí do cDNA. Pro PCR amplifikaci tyrosinázy byly použity priméry HTYR 1-4, rovněž byl testován nový primér T1. Priméry pro detekci MART byly MART 1-1 a 1-4, nested Melan 1-2. Pro detekci markeru MIA byla použita jednostupňová PCR s priméry MIA 3 a 4. Velikost produktů amplifikace byla potvrzena gelovou elektroforézou. Specifičnost tyrosinázových PCR produktů byla ověřena štěpením MvaI a hybridizací se specifickou sondou. Integrita izolované mRNA byla ověřena paralelní PCR s priméry pro b-aktin. Jako pozitivní kontrola byla testována RNA z lidského melanomu, negativní kontroly byly krevní vzorky zdravých osob nebo pacientů s Ca mammy. Citlivost PCR byla testována na buněčné linii SK-MEL-28.
V souboru 37 pacientů s kožním melanomem byla u 12 prokázána tyrosináza: u 1 z 8 pacientů stádia I, u 5 z 20 pacientů stádia II, 1 ze 4 pacientů stádia III a všech pacientů ve stádiu IV (5/5). Přítomnost MART byla zjištěna u 16 pacientů (3/8 stadium I, 6/20stadium II, 2/4 stádium III a 5/5 stádium IV). U 29 pacientů byl pozitivní marker MIA (6/8 u stádia I, 14/20 u stádia II, 4/4 u stádia III a 5/5 u stádia IV). Pozitivní nález všech testovaných markerů mělo 5 pacientů II stádia a všichni pacienti stádia IV. V sestavě 74 pacientů s očním melanomem byla exprese tyrosinázy, MART a MIA detekována u 29, 24 a 29 pacientů. Pozitivní výskyt všech markerů mělo 18 pacientů.