Závěrečná zpráva grantu 010/2002/C/1.LF

Název projektu:Reduktázová část syntázy oxidu dusnatého: strukturálně-funkční srovnávací studie
Hlavní řešitel:MUDr. Michaela Bodnárová
Spoluřešitelé: Prof.MUDr. Pavel Martásek, DrSc; MUDr. Lenka Pospíšilová; Ing. Kateřina Veselá; Aleš Král
Období řešení:2002-2003
Celková dotace:598 tis. Kč

Souhrn výsledků

Oxid dusnatý (NO) je významnou signální molekulou v lidské fyziologii. Tvorbu NO z L-argininu katalyzuje rodina tří prototypických savčích izoenzymů - syntáz oxidu dusnatého (NOS). NOS je aktivní jako homodimér. Každá podjednotka obsahuje reduktázovou a oxygenázovou doménu. Rozdíly mezi jednotlivými NOS na úrovni reduktazové části NOS jsou značné, ale hemové části se strukturálně liší jen minimálně. Reduktázová část NOS určujícím způsobem kontroluje rychlost přesunu elektronů k hemové části a tudíž i rychlost tvorby NO i možný vznik kyslíkových radikálů. Toto má významné patofyziologické důsledky. Cílem tohoto projektu, původně rozvrženého na tři roky, bylo studium strukturálních a funkčních vlastností reduktázových domén různých NOS. Výsledky by následně mohly být vodítkem k návržení NOS inhibitorů specifických pro jednotlivé isoformy.
 Pro jakékoliv strukturálně-funkční studie reduktázových částí NOS z  méně studovaných organizmů je podstatné mít jako srovnávací proteiny vždy cytochrom P450 oxidoreduktázu (CYPOR) a alespoň jednu dobře charakterizovanou savčí izoformu NOS. CYPOR byla získána z  laboratoře prof. Masters (USA), dále jsme připravili reduktázovou část endoteliální NOS. Navrhli jsme několik konstruktů (bez calmodulinového spojníku i s ním) a provedli expresi ve vektoru pCWori+ (který se nám osvědčil při expresi holo-NOS) a následnou purifikaci. Jak CYPOR, tak reduktázová část eNOS měly charakteristické spektrum flavoproteinů a očekávané biochemické charakteristiky (schopnost redukovat akceptory elektronů, cytochrom c, DCIP (2,6-dichlorophenodlindophenol) a ferrikyanid.
Z klonovaného genu NOS (ApNOS) zeje kalifornského (Aplysia californica) jsme překlonovali jeho reduktázovou část do vektoru pCWori+. Souběžně byla klonována reduktázová část NOS (DiNOS) z korála (Discosoma striata). Dále jsme připravili cDNA knihovnu z CNS sladkovodního plže plovatky bahenní (Lymnaea stagnalis). Reduktázová doména LymNOS je naprosto unikátní  vmezeřenou sekvenci v délce 83 aminokyselin v  části proteinu vážící NADP(H). Popis struktury této unikátní reduktázové části mezi NOS by byl výrazným přínosem k objasnění významu NADP(H) vážící domény při přenosu elektronů na FAD.
Klonované proteiny reduktázových částí ApNOS, DiNOS a LymNOS jsme exprimovali. Ke krystalizaci reduktázových domén NOS enzymů využijeme podmínek již optimalizovaných na spolupracujícím pracovišti. Biochemické parametry získaných proteinů jsou studovány řadou zavedených metod (obsah flavínových kofaktorů, redukce cytochromu c a ferrikyanidu, reoxidace redukovaných flavinů, oxidace NADPH a detekce superoxidu vzniklého reduktázovou doménou v přítomnosti/nepřítomnosti CaM).
Prezentace výsledků: Výsledky byly prezentovány na pěti mezinárodních kongresech, dvě abstrakta jsou časopisecky publikována. V přípravě je rukopis „Study of species specific NOS reductase domains and the effect of sequence variability on electron transfer“.