Závěrečná zpráva grantu 011/2003/C/1.LF

Název projektu:Methioninsynthasa-reduktasa: studium haplotypů a funkční analysa patogenity vybraných setřihových mutací
Hlavní řešitel:Ing. Petra Zavaďáková
Spoluřešitelé: MUDr. Viktor Kožich, CSc.; Kateřina Betincová; Ing. Jitka Sokolová; Ing. Eva Starcová; MVDr. Zorka Novotná
Období řešení:2003-2003
Celková dotace:300 tis. Kč

Souhrn výsledků

Methioninsynthasa-reduktasa (MTRR) je enzym nutný k redukční aktivaci methioninsynthasy, která se účastní remethylační cesty metabolizmu homocysteinu. Deficit MTRR způsobuje vzácné autozomálně recesivní onemocnění, homocystinurii typu cblE, které se projevuje v raném dětství megaloblastovou anemií a psychomotorickou retardací. V genu pro MTRR již bylo nalezeno několik patogenních mutací a dva běžné polymorfismy. Cílem této studie bylo nalézt a charakterizovat nové polymorfismy a mutace v MTRR genu, analyzovat MTRR haplotypy ve dvou vzdálených populacích a studovat chybný sestřih v genu pro MTRR.
Pomocí in silico analýzy a sekvenováním jsme v exonových oblastech MTRR genu nalezli celkem 16 SNP - 2 známé a 14 nových. Šest změn jsou missensové mutace (M22I, S175L, S257T, K350R, R415C, H595Y), osm polymorfismů je typu synonymní mutace a dvě změny jsou lokalizovány v 3´-nepřekládané oblasti cDNA pro MTRR. Pomocí metod PCR-RFLP jsme na 400 kontrolních alelách z české a africké (sub-saharské) populace určili frekvence variantních alel, které se pohybují v rozmezí od 0,02 do 0,56. Získaná genotypová data byla využita pro analýzu haplotypů pomocí statistického programu HAPMAX, který předpověděl celkem 12 nejpravděpodobnějších haplotypů. Osm haplotypů je společných pro obě populace, zatímco vždy dva haplotypy jsou privátní pouze pro jednu z populací. S využitím metody "maximum parsimony" bylo také možné odvodit evoluční strom MTRR alel s hypotetickým ancestrálním haplotypem. Ačkoliv získaná data ukazují, že gen pro MTRR je velmi polymorfní, existuje mezi jednotlivými SNP vysoký stupeň vazebné nerovnováhy, jelikož bylo nalezeno relativně málo haplotypů. Klinický význam polymorfismů a haplotypů v MTRR genu by měl být dále studován.
Nalezením třech patogenních mutací na obou rodičovských alelách u nově diagnostikovaných cblE pacientů jsme zvýšili počet patogenních mutací v genu pro MTRR. Všechny změny jsou mutace ovlivňující správný sestřih a vedou tak na úrovni mRNA k velkým delecím či insercím.
Dále jsme studovali patogenitu nejčastější mutace c.903_904ins140 v genu pro MTRR. Tato velká inserce je pravděpodobně způsobená aktivací exon splicing enhanceru (ESE) díky tranzici T>C uvnitř intronu 6. In silico analýza v oblasti domnělého ESE a jeho bezprostředním okolí potvrdila přítomnost kryptického sestřihového donoru i akceptoru a rovněž přítomnost silných ESE. Nalezené ESE jsou rozpoznávány sestřihovými faktory ASF/SF2 a SC35. V souvislosti s touto studií jsme také zavedli exon-trapping systém, pomocí kterého lze testovat chybný sestřih.
V bezprostřední blízkosti kryptického exonu jsme také nalezli a charakterizovali nový polymorfismus typu VNTR. Opakující se jednotka je složená z 29 bp a je tandemově opakovaná 5, 9 či 10 krát. Tento VNTR je tzv. nekompletní, jelikož jsme zjistili, že se v repetetivních jednotkách vyskytují nukleotidové změny. Funkční význam a možný vliv VNTR na normální či chybný sestřih bude dále zkoumán.
Tento projekt prohloubil základní znalosti o variabilitě genu pro MTRR, pomohl pochopit jeho evoluci, rozšířil spektrum patogenních mutací a objasnil patogenitu nejčastější mutace v MTRR genu. V neposlední řadě umožnil vědeckou výchovu pre- a postgraduálních studentů, umožnil navázání mezinárodní spolupráce a zároveň otevřel několik nových výzkumných témat.