Závěrečná zpráva grantu 019/2002/C/1.LF

Název projektu:Optimalizace CFU-F eseje ke stanovení proliferačního potenciálu mezenchymových progenitorových buněk u pacientů s lymfoidními malignitami
Hlavní řešitel:MUDr. Robert Pytlík
Spoluřešitelé: Mgr. Tereza Purkrábková; MUDr. Hana Strnadová; MUDr. Petra Obrtlíková; Prof.MUDr. Karel Smetana
Období řešení:2002-2003
Celková dotace:490 tis. Kč

Souhrn výsledků

Podpora GAUK vyústila v publikaci tří full-textových článků a šesti abstrakt. Hlavním výstupem je zpracování reprodukovatelné kvantitativní eseje pro růst mezenchymových progenitorových buněk (MSC). Mezenchymové buňky jsou expandovány v selektivním médiu z mononukleárů kostní dřeně. Hustota úvodního inokula výrazně ovlivňuje růstové vlastnosti mezenchymových buněk v dalších pasážích. Při úvodním platingu nízkých koncentrací (cca 1000 mononukleárů/cm2) je esej lépe reprodukovatelná než při platingu vysokých koncentrací (100 tis buněk/cm2). Počet mezenchymových kolonií ve druhé pasáži (CFU-F2) stoupá lineárně  s počtem nasazených buněk pouze tehdy, jestliže při první pasáži byl použit nízký plating. Při oboustranných odběrech od jednoho pacienta ve stejný den bylo možno korelovat výsledky CFU-F2 pouze tehdy, jestliže byl v první pasáži použit nízký plating. Lymfoidní malignity, zejména chronická lymfadenóza a mnohočetný myelom, s největší pravděpodobností mění růstové vlastnosti mezenchymových kmenových buněk, přičemž při nízkém platingu je u těchto onemocnění dosaženo vyšší efektivity tvorby CFU-F2 než při vysokém platingu. CFU-F esej může mít využití při hodnocení expandibility MSC k užití v tkáňovém inženýrství, např. v ortopedii.
Pluripotence mezenchymových kmenových buněk byla ověřena jejich kultivací v osteogenním a adipogenním diferenciačním médiu. Pomocí průtokové cytometrie byl stanoven fenotyp mezenchymových kmenových buněk, přičemž pro jejich definici se nejlépe osvědčila kombinace znaků CD90 a CD29 (téměř 100% pozitivní) a CD45 s CD34 nebo CD14 (obligatorně negativní). Trojkombinace CD90 FITC, CD29 PE a CD45 APC může být využito k sortingu MSC na průtokovém cytometru.
Mezenchymové buňky exprimují galektin 1 a vazebná místa pro galektin 1, avšak nikoli galektiny 3, 5 či 7. Galektin-1 je přítomen v jádře i cytoplazmě, zejména u dělících se buněk. V jádře galektin-1 kolokalizuje s pre-mRNA splicing faktorem SC-35 a jeho vazba je blokovatelná natrávením RNAzou, avšak nikoli DNAzou. V jadércích je galektin-1 kolokalizován s fibrilarinem a nukleofosminem B23. Tyto výsledky ukazují na úlohu galektinu 1 při konečných úpravách messengerové RNA. Galektin 1 může hrát roli i v imunomodulačních mechanismech, které jsou připisovány mezenchymovým kmenovým buňkám. Přidání laktózy do kultivačního média s MSC vedlo k vyššímu přežívání alogenních, fytohemaglutininem stimulovaných periferních mononukleárů než inkubace se samotnými MSC. Tyto změny však nejsou velké, je tedy pravděpodobné, že předpokládaný pro-apoptotický efekt galektinu 1 je vyvážen antiapoptotickou signalizací prostřednictvím jiných povrchových molekul.
Růstové vlastnosti mezenchymových buněk jsou ovlivňovány přítomností růstových faktorů a MSC produkují růstové faktory nezbytné pro fyziologickou vaskularizaci i nádorovou neovaskularizaci. Za přispění GAUK byly zavedeny kvantitativní mRNA eseje umožňující stanovit expresi genů pro vaskulární růstové faktory a jejich receptory. Prostřednictvím průtokové cytometrie byl na povrchu MSC nalezen receptor KDR pro vaskulární endotelový růstový faktor A (VEGF-A). Další zkoumání exprese růstových faktorů a jejich receptorů na úrovni mRNA a proteinů může vést k lepšímu pochopení chování stromálních buněk za fyziologických a patologických podmínek.