Závěrečná zpráva grantu 054/2002/C/2.LF

Název projektu:Možnosti užití real time PCR a kvantitativní komparativní PCR k detekci dávky PLP genu u pacientů s fenotypem Pelizaeus Merzbacherovy choroby
Hlavní řešitel:MUDr. Pavel Seeman
Spoluřešitelé: MUDr Pavel Kršek, Ph.D.; MUC. Vladimír Beneš; Kateřina Gebertová; MUC. Vladimir Beneš; MUDr. Emilie Mikešová; Mgr. Iva Sakmaryová
Období řešení:2002-2003
Celková dotace:538 tis. Kč

Souhrn výsledků

1. Byla úspěšně vyzkoušena metoda QFPCR  k porovnání počtu kopií resp. dávky PLP genu oproti referečnímu CFTR genu i oproti DMD genu. Byly získány reprodukovatelné výsledky prokazující přítomnost PLP duplikace u pacientů s fenotypem klasické formy PMD i u žen obligátních přenašeček v rodině.
2. Bylo vyzkoušeno využití mikrosatelitového dinukleotidového intragenového polymorfizmu ( Mimault et al 1995)  a tento doplněk jsme shledali jako velmi přínosný k detekci žen přenašeček PLP duplikace. U žen přenašeček PLP duplikace je  dobře detekovatelný rozdíl intenzit jednotlivých alel v markeru. Dále použití tohoto markeru bylo (i díky velmi dobré informativitě) velmi přínosné pro průkaz de-novo vzniku PLP duplikace a jejího původu.
3. Bylo kompletně vyšetřeno celkem 15 nepříbuzných pacientů resp. rodin s klinickou diagnozou PMD. V 7 rodinách byla prokázána přítomnost PLP duplikace u postižených pacientů. Na přítomnost duplikace PLP1 genu bylo celkem vyšetřeno 115 osob, včetně příbuzných v riziku. Ve 3 ze  7 pozitivních rodin šlo o familiární případy a ve 4 rodinách šlo o sporadické  případy postižení PMD. V těchto 4 rodinách se sporadickým výskytem PMD jsme u všech prokázali de-novo vznik duplikace u otců matek postiženého pacienta. Duplikace vznikla ve všech 4 případech de-novo mutace v paternální meiose – spermatogenezi otce matky pacienta. Ve všech pozitivních případech s nálezem PLP duplikace u pacienta byla tedy i matka přenašečkou PLP duplikace.
4. Real time PCR k detekci dávky PLP genu u pacientů s PMD se ukázala jako velmi dobře použitelná a schopná spolehlivě odlišit jedince resp. vzorky DNA s jednou a dvěma kopiemi PLP1 genu v genomu, tedy spolehlivě odlišit pacienta-muže s duplikací PLP genu od muže s normálním počtem kopii, tedy jednou kopií PLP1 genu. Pomocí real time PCR se podařilo ve všech případech s duplikací PLP1 genu správně určit genotyp.
5. Porovnání ukázalo, že obě metody jsou spolehlivě schopny prokázat nebo vyloučit duplikaci PLP genu u pacientů s PMD. Real time PCR se ukázala jako rychlejší a snadnější. Pro použití detekce dávky PLP1 genu u žen, však považujeme za nezbytné použití obou metod a zařazení intragenového markeru (Mimault et al. 1995)
6. Vzhledem k tomu, že 3 z námi zachycených pacientů se narodili ve třech po sobě následujících letech (2000, 2001 a 2002) a v roce 2001 jsou narozeni 2 z pacientů s PMD a s prokázanou duplikací PLP genu, je možné z našich výsledků udělat i předběžné závěry o frekvenci PMD v naší populaci. Lze počítat s frekvencí PMD nejméně 1: 45 000 až 1: 90 000. Je patrné, že choroba Pelizaeus Merzbacherova byla a je u nás poddiagnostikována. U významné části pacientů je stanovena nesprávná diagnosa – často dětské mozkové obrny – DMO.
8. Byla provedena první dvě prenatální vyšetření s příznivým výsledkem v obou případech.
9. Vyšetřili jsme unikátní rodinu s mnohočetným výskytem PMD a prokázali jsme přítomnost PLP duplikace u všech postižených chlapců či mužů. Celkem byla dosud v této rodině (dosud vyšetřeno v naší laboratoři 37 osob ) duplikace PLP genu prokázána u 4 mužů a chlapců a u 11 žen.V této rodině došlo v jedné z jejích větví k rekombinaci v oblasti duplikovaného úseku.
10. Vyšetřili jsme rozsah duplikovaného úseku oblasti PLP1 genu u všech pacientů s prokázanou PMD duplikací a zjistili jsme velkou variabilitu rozsahu této duplikace.  Rozsah PMD duplikace  pacientů je velmi různý a to jak velikostí duplikovaného úseku tak i postiženou oblastí a každá z duplikací je unikátní pro každou rodinu. Podrobnější mapování míst zlomů nalezených přestaveb v oblasti Xq22 je předmětem našich dalších rozsáhlejších studií.