Závěrečná zpráva grantu 085/2001/C/LFHK

Název projektu:Screening a diagnostika dědičných poruch glykosylace
Hlavní řešitel:MUDr. Eliška Marklová, CSc.
Spoluřešitelé: Ing. Jaroslava Vávrová, PhD; Monika Říhová; Ondřej Renc; Martina Sutnarová; Václava Menclová; MUDr. Ziad AlBahri
Období řešení:2001-2003
Celková dotace:675 tis. Kč

Souhrn výsledků

Klinická diagnostika CDG je komplikována velmi rozmanitou symptomatologií, která je navíc obvykle věkově závislá. Lze očekávat, že řada dědičných metabolických poruch dosud neznámé etiologie může být posléze diagnostikována jako CDG. Jediný screeningový test použitelný pro všechny až dosud rozpoznané typy CDG neexistuje.
Cílem výzkumu bylo zavedení screeningu CDG, stanovení algoritmu diagnostiky a presentace vlastních výsledků. Zavedli jsme různé vyšetřovací techniky, zejména isoelektrofokusaci (IEF) transferinu (Tf) s přímou imunofixací, a dále postup elektroforetické separace Tf na agaróze s pasivním blotováním a imunodetekcí. Sledovali jsem vliv předčištění Tf afinitní chromatografií na výsledek separace isoforem metodou IEF a zejména pak HPLC analýzou. Kromě Tf jsme testovali i některé další glykoproteiny a vypracovali postup současného IEF-stanovení Tf a alfa1-antitrypsinu v jedné analýze. Diagnostický proces byl doplněn fotometrickým měřením aktivity enzymů v izolovaných leukocytech. Získali a popsali jsme řadu poznatků a zkušeností při provádění jednotlivých kroků uvedených postupů. Jako materiálu lze použít kromě séra i mozkomíšního moku a suché kapky celé krve, séra a dalších typů tělních tekutin.
Vyšetřili jsme kolem 120 zdravých osob různého věku, přes 800 dětí/dospělých se známkami dědičné poruchy metabolismu, několik skupin osob s izolovanými CDG-suspektními příznaky (např. pigmentová retinopatie, nystagmus) a pacienty s některými dalšími typy chronického onemocnění (např. cystická fibróza, astma bronchiale, epilepsie). CDG-pozitivní vzorky získané z jiných laboratoří, stejně tak jako séra (zvl. nedonošených) novorozenců, osob s abusem alkoholu a nemocných s jaterními chorobami sloužily jako patologický referenční materiál.
Tf vykazuje značný genetický (proteinový) polymorfismus; pro správnou interpretaci výsledku screeningu je nutná dobrá znalost chování různých proteinových variant. V našem souboru jsme nejčastěji identifikovali variantu Tf C1 (v 84 % u kontrol a v 79 % ve skupině pacientů), a heterozygotní typ Tf C1C2 s vysokou frekvencí výskytu zejména u dětí s Crohnovou chorobou (30 %) a cystickou fibrózou (27 %), ve srovnání s kontrolní skupinou (16 %). Mezi další vzácnější varianty patří Tf C2, C1/C3, C1/B a C1/D (zjištěny v 0,48; 0,39; 0,24 a 0,24 % sledovaného souboru). Na případu 12letého chlapce (léčeného metotrexátem pro dg. ankylosující spondylitida) se vzácnou genetickou variantou Tf C1/D4-5 lze demonstrovat riziko chybné interpretace výsledku IEF.
Mírné poruchy glykosylace, zjištěné v 6,7 % vyšetřených pacientů našeho souboru byly spojeny s různými symptomy a diagnózami (např. Hashimotova thyroiditis, Budd-Chiarri syndrom, systémový lupus erythematosus a epilepsie), kromě jaterních chorob, revmatoidní artritidy a cystické fibrózy. Výsledky IEF přitom nekorelovaly s hodnotami celkového Tf a aAT v séru. Nejvýraznější patologický nález s vyšším zastoupením  disialo-Tf zjištěný u 4-letého chlapce odpovídá spíše CDG typu II; porucha glykosylace je patrná i při IEF alfa1-antitrypsinu a analýze Tf elektroforézou na agaróze. Aktivita enzymu nejčastějšího typu CDG Ia v leukocytech byla jen mírně snížena, analýza mutací dosud probíhá. Další vyšetření rodiny pacienta prokázalo stejný typ genetické varianty C1C2 u matky, ale fyziologický IEF nález u obou rodičů.
Přehled připravených publikací (s uvedením podpory tímto grantem) doma a v zahraničí:
přednášky (3 + 2); posterová sdělení (5 + 5); publikované souhrny (4 + 5); články (2 + 3).