Účinek heterologních genů na mutagenezi provázející hladovění
Hlavní řešitel:
Mgr. Tomáš Cápal
Spoluřešitelé:
RNDr. Vladimír Vondrejs, CSc.
Období řešení:
2002-2003
Celková dotace:
185 tis. Kč
Souhrn výsledků
Dosavadní studium za adaptivní mutageneze u kvasinky Saccharomyces cerevisiae ukázalo, že inaktivace různých genů, které se podílejí na opravách DNA (LIG4, MMS2, PMS1, RAD1, RAD5, RAD6, RAD14, RAD18, RAD30, RAD52, RAD54, REV3) a některých dalších genů signální dráhy (RAS2) ovlivňuje mutagenezi provázející hladovění (SAM) kvasinky S.cerevisiae. V této práci byl pomocí metod založených na sledování vzniku kolonií Ade+ revertantů při hladovění na adenin, Trp+ revertantů při hladovění na tryptofan a Lys+ revertantů při hladovění na lysin, analyzován vliv heterologních transkripčních aktivátorů: protoonkogenu c-myb, onkogenu v-myb (z viru AMV) a prionu [PSI+] na SAM v různých kmenech S.cerevisiae (BJC3, YCP1). Bylo prokázáno, že protoonkogen c-myb nepotlačuje SAM během hladovění na adenin tolik, jako onkogen v-myb. Onkogen v-myb výrazně stimuluje SAM během hladovění na tryptofan, zatímco efekt c-myb je v tomto případě nulový. Uázalo se, že se rychlost hynutí u sledovaných kmenů během hladovění na adenin ani tryptofan nijak výrazně nelišilí a předpokládáme, proto, že sledované rozdíly mezi c-myb a v-myb nejsou způsobeny odlišnou rychlostí hynutí. SAM během hladovění na lysin je výrazně ovlivněna v přítomnosti v-myb i c-myb a to stejným způsobem jaký byl sledován v případe hladovění na tryptofan (výrazné zesílení SAM). Zdá se, že existuje zásadní rozdíl mezi mechanismy SAM u genů biosyntetické dráhy aminokyselin (TRP1 a LYS2) a genů pro biosyntézu nukleotidů (ADE2). V genech TRP1 a LYS2 byl totiž pozorován výrazný stimulační efekt na SAM, zatímco u genu ADE2 byl pozorován efekt opačný. Bohužel nejsme v tuto chvíli schopni říci jakou měrou je zasažena transkripce zmiňovaných genů v přítomnosti heterologních transkripčních aktivátorů studovaných v této práci. Vliv jednotlivých domén v-myb na SAM není zcela jasný. Zdá se, že efekt jednotlivých domén na SAM je závislý na genovém pozadí konkrétního kmenu. Největší efekt (výrazné potlačení) na SAM během hladovění na adenin obou sledovaných testovaných kmenů (BJC3 i YCP1) bylo pozorováno u kmenu s divokou alelou v-myb. Mutace v DBD má nejmenší vliv na pozorovaný efekt v-myb v kmenu BJC3, zatímco v kmenu YPC se její vliv jeví zcela opačně (zdá se že její funkce je na efektu v-myb nejdůležitější). Obráceně platí,že mutace v TAD se jeví nejzávažnější v kmenu BJC3, zatímco v kmenu YCP1 se její funkce jeví jako málo významná. Mutace v ostatních doménách vykazují intermediární charakter a tak je obtížné interpretovat jejich význam na vlivu v-myb na SAM. Prion [PSI+] je prionová forma proteinu Sup35p, který hraje roli translačního terminačního faktoru eRF3. Přítomnost prionu [PSI+] v buňce zesiluje tzv. slabé supresory. Byla využita metoda léčení prionu [PSI+] kultivací v 5mM roztoku guanidin-hydrochloridu pro vyléčení kvasinkových kmenů od tohoto prionu. Byl analyzován efekt prionu [PSI+] na SAM během hladovění na adenin u několika polyauxotrofních [PSI+] kmenů S.cerevisiae (K699 a BJC3). Byl pozorován výrazný efekt prionu [PSI+] na SAM. Vyléčené kmeny [psi-] vykazovaly výrazné snížení SAM oproti původním neléčeným [PSI+] kmenům. Pozorovaný efekt jistě není způsoben rozdílnou rychlostí hynutí, neboť křivky hynutí obou kmenů jsou velice podobné. Analýza revertantů prokázala, že reverze u vyléčených [psi-] kmenů jsou způsobeny především mutacemi intragenového charakteru, zatímco reverze u prionového [PSI+] kmene jsou větší měrou způsobeny také intergenovými supresemi.