Závěrečná zpráva grantu 121/2003/B-BIO/PřF

Název projektu:Úloha cytoskeletu v regulaci somatické embryogeneze u jehličnanů
Hlavní řešitel:Mgr. Petra Boříková
Spoluřešitelé: Prof.RNDr. Zdeněk Opatrný, CSc.; Mgr. Jindřiška Pokorná; Mgr. Kateřina Schwarzerová
Období řešení:2003-2003
Celková dotace:198 tis. Kč

Souhrn výsledků

Projektový návrh byl přijat v březnu 2003. Jedná se o práci dlouhodobějšího charakteru a předkládané výsledky jsou částí rozsáhlejšího výzkumu této problematiky, který bude probíhat v následujících letech a je hlavním tématem dizertační práce hlavní řešitelky.
Byl proveden základní výběr pokusného materiálu s ohledem na odlišnou schopnost smrkových kultur tvořit somatická embrya a bylo zvládnuto trvalé pěstování a hodnocení těchto kultur v podmínkách PřF UK. Byla tedy zavedena kultivace standardní kultury AFO (schopnost tvořit zralá somatická embrya je nenarušena), dále kultur C101N a AFON (kalusové kultury, bez schopnosti tvořit nezralá proembrya i zralá embrya) a kultury C203 (pouze proembryogenní kultura, schopnost maturace somatických embryí je narušena). Linie s narušenou nebo nulovou schopností embryogeneze jsou používány jako referenční materiál vedle standardní embryogenní linie AFO s předpokladem, že případné rozdíly v jejich základní biochemické či molekulární analýze by mohly souviset s vlastním embryogenním procesem a přispět tak k bližšímu pochopení jeho mechanizmů.
Byla provedena základní růstová, morfologická a cytologická studie vybraných kultur, charakterizující podrobně změny fenotypu za „indukčních“ (tedy maturaci navozujících) i „neindukčních“ (udržovacích) podmínek.
Po úspěšné optimalizaci protokolu detekce mikrotubulárního a aktinového cytoskeletu bylo provedeno základní porovnání CSK struktur v buňkách linie AFO za „neindukčních“ podmínek a v raných fázích po indukci maturace. Výsledky zatím naznačují, že během raných fází maturace nedochází k významným změnám ve struktuře cytoskeletální sítě žádného ze základních typů buněk oproti kontrole.
Následovala analýza biochemická resp. molekulární. U linií AFO, C203 i AFON pěstovaných za udržovacích podmínek a za podmínek navozujících maturaci byly pozorovány pomocí SDS-PAGE a Westernblottingu hladiny základních cytoskeletálních proteinů (alfa-tubulin, beta-tubulin, tyrozinovaný alfa-tubulin, acetylovaný alfa-tubulin). Prozatím nebylo potvrzeno, že se množství jednotlivých cytoskeletálních proteinů významně mění v rané fázi maturace. U linie AFO však dochází po čtyřech až pěti týdnech maturace ke zvýšení obsahu tyrozinovaného alfa-tubulinu a snížení obsahu acetylovaného alfa-tubulinu.
Dále byla provedena izolace RNA z kultur kontrolních i po indukci maturace (AFO, C203, AFON). Pomocí navržených primerů pro alfa-tubulin, beta-tubulin a aktin byla provedena u těchto vzorků RT-PCR a PCR. Výsledky prokazují vhodnost a metodickou použitelnost námi navržených specifických primerů pro analýzu všech tří typů genů. Sekvence DNA, získaná z varianty „AFO-kontrola“ pomocí primerů pro alfa-tubulin a aktin, je v současné době klonována a sekvenována. Další analýzy budou směřovat k testování dynamiky cytoskeletálních transkriptů během maturace.
Část těchto výsledků byla publikována formou panelového sdělení na Konferenci rostlinné fyziologie pro PhD studenty a mladé vědce v Brně, červen 2003.

Boříková, P., Opatrný, Z.: Changes in Cytoskeleton during Maturation of Norway Spruce Somatic Embryos. Poster Presentation. Book of Abstracts, 26 –27. Plant Physiology Conference of Ph.D. Students and Young Scientists. 24. – 25.6. 2003.