Závěrečná zpráva grantu 129/2003/B-BIO/PřF

Název projektu:	Stresové bílkoviny bakteriální membrány
Hlavní řešitel:	Doc. Jaroslava Svobodová, CSc.
Spoluřešitelé:	Mgr. Aleš Ulrych; Mgr. Lenka Šemberová; RNDr. Denisa Petráčková; Mgr. Ondřej Toman; RNDr. Ivo Konopásek, CSc.; Mgr. Martin Holub; RNDr. Jaroslav Weiser, CSc.
Období řešení:	2003-2003
Celková dotace:	145 tis. Kč

Souhrn výsledků

V rámci projektu byla řešena otázka adaptace bakteriální membrány Bacillus subtilis na změny vnějšího prostředí. V první fázi byl optimalisován kultivační protokol, který zajišťuje konstantní fysiologický stav bakterií a je podmínkou reprodukovatelnosti experimentů. Adaptační proces byl sledován v čase: bezprostřední odpověď bakterie na stresor v 15. a 30. minutě a po dlouhodobém působení stresu (5 hodin, resp. 20 hodin). Bacillus subtilis roste v kontrolních podmínkách s dobou zdvojení T = 17 minut. V přítomnosti etanolu (3 % etanol v kultivačním mediu) se růstová rychlost bakterie sníží, doba zdvojení se prodlouží na 25 minut, a to jak bezprostředně po působení stresoru (30 minut), tak i při dlouhodobé adaptaci. Při stresu detergentem SDS (100 mM - krátkodobá adaptace, resp. 250 mM - dlouhodobá adaptace - 20 hodin) se doba zdvojení bakterie zvýší na 23 minut bez ohledu na dobu kultivace bakterií se stresorem.
Z bakterií vystavených příslušnému stresovému faktoru byly enzymatickou metodou isolovány cytoplasmatické membrány a následně analysováno složení membránových proteinů pomocí jednorozměrné elektroforesy bílkovin (1D SDS-PAGE). Bylo zjištěno, že etanol i SDS proteinovou složku membrány Bacillus subtilis prokazatelně modifikují. Tyto výsledky vedly následně k detailnímu studiu změn membránového proteomu pomocí 2D SDS - PAGE.
Hlavním předpokladem standardisované separace membránových bílkovin je spolehlivé zvládnutí metodiky 2D elektroforesy. Pozornost se soustředila zejména na dělení vzorků proteinů v prvním rozměru, tj. na isoelektrickou fokusaci. V původním uspořádání probíhala isoelektická fokusace ve skleněných kapilárách s polyakrylamidovým gelem v rozmezí pH 3-10 a dovolovala rozdělení maximálně 100 mg proteinů v gelu. Tak bylo v gelech o velikosti 25 x 22 cm detegováno pouze cca 300 proteinových skvrn. Dělení probíhalo na přístrojích od firmy Oxford-Glycosystem. Zavedení modifikace využívající IPG (immobilized pH gradients) stripy přineslo možnost zvýšit množství vzorku na gel až na 300 mg proteinů a tím i detekci téměř 600 proteinových skvrn. Pro analysu membránových bílkovin B. subtilis bylo výhodné použít stripy s rozmezím pH 4 - 9. K separaci proteinů byla použita aparatura od firmy Hoefer s gely 12 x 16 cm. Jednorázová příprava IPG stripů poskytuje velkou sérii identických matric pro separaci proteinů a zvyšuje tak reprodukovatelnost profilu proteomu z nezávislých experimentů. Proteomy získané oběma postupy nebylo možno vzájemně exaktně porovnat kvůli různé velikosti gelů a nanášce proteinů na jednotlivé gely (viz Obr. 1 a 2 v příloze).
Předběžné výsledky získané takto vypracovanou metodou 2D SDS-PAGE naznačují přítomnost tří nových membránových proteinů Bacillus subtilis indukovaných etanolovým stresem. Jejich charakterisace a identifikace bude předmětem dalšího výzkumu, podobně jako analysa změn membránového proteomu indukovaných detergentem SDS.