Mechanismus působení melatoninu na gonadotropní buňky.
Hlavní řešitel:
Doc. RNDr. Růžena Novotná, CSc.
Spoluřešitelé:
Mgr. Aleš Balík;
Zdeňka Kučerová
Období řešení:
2001-2003
Celková dotace:
295 tis. Kč
Souhrn výsledků
Projekt byl zaměřen na řešení problému inhibičního působení melatoninu na neonatální gonadotropní buňky adenohypofýzy potkana. Signálem pro uvolňování hormonů z gonadotropních buněk je působení GnRH, který aktivuje PI signální kaskádu a způsobuje vzestup druhých poslů DAG a IP3. Vzestup IP3 vede ke zvýšení Ca2+ z intracelulárních, IP3 senzitivních zdrojů.Výsledkem aktivace této signální kaskády je zvýšení výdeje LH. Cílem projektu bylo zjistit, zda melatonin inhibuje účinky GnRH cestou inhibice PI signální kaskády a tvorby IP3 v primární tkáňové kultuře buněk adenohypofýzy u neonatálních potkanů stimulovaných GnRH. Koncentrace IP3 byla stanovena vazebnou reakcí s receptory pro IP3 a kompeticí s přidaným radioakt. 3HIP3. Receptor pro IP3 byl připravován z mozečku potkanů. V práci bylo stanovováno také uvolňování LH u GnRH stimulovaných gonadotropních buněk a u buněk inkubováných s melatoninem. Zjistili jsme, že GnRH způsobuje u neonatálních gonadotropních buněk potkanů zvýšený výdej LH, stejně jako u dospělých zvířat. Současná inkubace buněk s GnRH a melatoninem však zvýšení výdeje LH nevyvolá. Melatonin působí inhibičně na výdej LH z tkáň. kultury neonatálních gonadotropních buněk potkana. Pro výdej LH je nezbytné zvýšení intracelulárního vápníku. Jednou z možností inhibičního působení melatoninu na výdej LH z gonadotropních buněk je blokování PI signál. kaskády melatoninem, který by byl následován poklesem Ca2+ z jeho intracelulárních zdrojů. Sledovali jsme koncentrace IP3 u buněk stimulovaných GnRH, melatoninem nebo současně melatoninem + GnRH. Stimulace GnRH signifikantně zvýšovala koncentraci IP3. Přidání melatoninu do media před nebo současně s GnRH však snižovalo konc. IP3 jen o 10 až 25 %.Toto snížení bylo n.s. Zvýšení intaracelulární hladiny kalcia vlivem aktivace fosfolipázy C (PLC) bylo popsáno u alfa T3-1 gonadotropů ovlivněných PACAP. V našich pokusech však PACAP aktivitu PLC ani konc. IP3 a výdej LH neovlivnil. Také blokáda PLC vlivem U73122 která u alfa T3-1 gonadotropů stimulovaných GnRH snížila konc. IP3 ,kalcia a LH byla u neonatálních gonadotropů bez účinku. Inkubace buněk stimulovaných GnRH v mediu bez kalcia však způsobovala inhibici výdeje LH. Zdá se, že inhibiční účinek melatoninu u neonatálních gonadotropních buněk je spíše způsoben blokádou vtoku (influxu) Ca2+ do buněk než blokádou výdeje kalcia z jeho intracelulárních zdrojů. Nevýhodou je, že metodicky zatím nelze oddělit jednotlivé typy gonadotropních buněk. Různé typy gonadotropních buněk mohou mít různě řízené mechanismy buněčné signalizace. Studovaná problematika a získané výsledky mohou být touto skutečností ovlivněny. Výsledky byly publikovány na třech mezinárodních kongresech (viz přílohy). Novotná,R., Balík, A.: The effect of melatonin on GnRH stimulated neonatal rat pituitary gonadotroph cells. Abstracts 25-th Inter. Soc.Chonobiol. p.80 2001. Novotná, R., Balík, A.: The mechanism of melatonin inhibitory effect on GnRH stimulated neonatal rat pituitary cells. FENS (Paříž) Abstracts no.0.89,p.20, 2002. Novotná,R., Balík, A.: Role of melatonin in GnRH signal transduction in rat neonatal gonadotroph cells. FENS (Lisabon) 2004, (přijato do tisku). V rámci zaměření na problematiku hormonální buněčné signalizace jsme ve spolupráci s Universitou v Římě " Tor Vergata" studovali také vliv insulinu na metabolismus membránovách fosfolipidů u hepatocytů, HEPG2, buněk. Výsledky práce byly publikovány: R.Novotná, P.De Vito. L. Currado, P. Luly, P.M. Baldiny: Involvement of Phospholipids in the Mechanism of Insulin Action in HEPG2 Cells. Physiol. Res. 52:447-454,2003.