Závěrečná zpráva grantu 166/2002/B-FYZ/MFF

Název projektu:Fluorescenční měření změn mitochondriálního membránového potenciálu při geneticky podmíněných mitochondriálních chorobách
Hlavní řešitel:Mgr. Alena Vojtíšková
Spoluřešitelé: Doc. RNDr. Jaromír Plášek, CSc; MUDr. Josef Houštěk, DrSc; Ondřej Šebesta
Období řešení:2002-2003
Celková dotace:125 tis. Kč

Souhrn výsledků

Projekt byl zaměřen na studium změn mitochondriálního membránového potenciálu (??m) ve fibroblastech pacientů s poruchami terminálního enzymu dýchacího řetězce - cytochrom c oxidázy (COX) souvisejícími s mutacemi v  jaderném genu SURF1, který kóduje COX-specifický asemblační protein Surf1p. Porucha se klinicky projevuje jako subakutní nekrotizující encefalomyopatie, tzv. Leighův syndrom (LSCOX). Naším cílem bylo zjistit, jakým způsobem se mění proton-translokační aktivita porušené COX  a jak ovlivňuje velikost ??m ve fibroblastech.
Při studiu změn ??m jsme vyšli ze zavedené metody využívající fluorescenční sondu tetramethylrhodamin methyl ester (TMRM) a proudovou cytometrii. První část projektu byla zaměřena na kvalitativní vyhodnocení změn ??m při funkční zátěži dýchacího řetězce. Z výsledků vyplývá, že fibroblasty pacientů s LSCOX mají porušenou tvorbu a udržování ??m. V dalším kroku jsme analyzovali proton-translokační aktivitu samotné COX (TMPD+askorbát). Ukázalo se, že proton-translokační aktivita enzymu je výrazně porušená a je příčinou snížených hodnot ??m.
Navrhli jsme a vypracovali protokol hodnocení fluorescenčních měření, který umožňuje určit změny ??m v jednotkách mV (viz přiložený manuskript). Pomocí tohoto protokolu jsme potvrdili výše uvedené výsledky v absolutní škále.  
Dále jsme zavedli metodu kvantifikace změn ??m na konfokálním mikroskopu se sondou TMRM, pomocí které jsme schopni sledovat kontinuálně rozdíly v ??m mezi fibroblasty pacientů LSCOX a kontrol. Výsledky prvních měření na konfokálním  mikroskopu potvrzují výsledky naší  cytofluorimetrické analýzy.
Měření změny ??m  u dvou pacientů s mutacemi v genu ATP6, který kóduje podjednotku a ATP syntázy.  Výsledky ukázaly, že pacient s mutací v iniciačním kodónu (8527A>G) má normální funkci ATP syntázy ve srovnání s kontrolou. Oproti tomu u pacienta s mutací ve stop kodónu ATP6 genu (9205?TA) analýza ukázala neschopnost ATP syntázy využívat protonový gradient pro syntézu ATP.

Výstupy projektu:
Článek (odb. period.)    3
Postery na mezinárodní konferenci   3